重组花生过敏原Ara h2壳聚糖纳米粒的制备及其抗过敏作用

论文摘要

花生过敏是一个引起人们高度关注的食品安全问题,花生过敏多见于速发型过敏反应,有较高的患病率,并且危害患者的生命。迄今为止,国外学者在花生过敏的治疗方面做了许多相关的研究,却没有发现很好的治疗手段,最佳的方法就是避免摄入花生相关的食品。本研究根据壳聚糖具有组织相容性好、毒副作用小,对人体无危害等优良性质,结合壳聚糖纳米粒的缓释以及不易被消化等特性,制备重组Ara h2壳聚糖纳米粒,研究该纳米粒在花生过敏小鼠中的作用。本论文工作包括花生过敏原Ara h 2的原核表达及纯化、重组Ara h 2壳聚糖纳米粒的的制备、花生过敏小鼠模型的构建及重组Ara h 2壳聚糖纳米粒抗过敏作用的实验动物学研究。主要研究工作结果及结论如下。1人工合成Ara h 2基因,利用基因工程技术成功地构建了pET-32a-Ara h 2表达载体,并将其转入E.coli origami宿主菌中,酶切分析显示构建正确。经DNA测序分析表明插入片段位置、方向、大小序列均正确。用IPTG进行诱导,通过不连续SDS-PAGE电泳分析,获得了分子量约为35kD的表达蛋白,与理论值相符。菌体经过超声粉碎,分离超声后的上清和沉淀,分别进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明表达蛋白为部分可溶性。用Ni2+亲和层析柱纯化含有His标签的重组Arah2蛋白,纯化得到了重组Ara h 2蛋白。2采用离子交联法制备重组Ara h 2壳聚糖纳米粒,重组Ara h 2被壳聚糖包裹后,通过BCA法检测蛋白浓度并计算重组Ara h 2壳聚糖纳米粒的包封率和载药率。SDS-PAGE电泳检测表明,Ara h 2被成功地包裹在壳聚糖中,扫描电镜（SEM）鉴定该纳米粒粒径为230nm-670nm,进一步用花生过敏病人血清作为一抗进行Western-Blotting分析,结果发现重组Ara h 2壳聚糖纳米粒能与血清特异性IgE结合,表明已成功制备了具有免疫原活性的重组Ara h 2壳聚糖纳米粒。3将用丙酮脱脂法提取的花生粗蛋白通过皮下注射C57BL/C小鼠致敏,同时设立阴性对照（Naive）组,然后再用重组Ara h 2壳聚糖纳米粒经灌胃给药治疗致敏小鼠,并分别设立重组Ara h 2和壳聚糖纳米粒对照组。处死小鼠,用ELISA法检测血清特异性IgE、IgG2a、血浆组胺水平及脾细胞分泌IL-4、IL5、IL13、IFN-r的水平。与其它组相比,经过重组Ara h 2壳聚糖纳米粒治疗后,明显降低血清特异性IgE及血浆组胺水平,上调特异性IgG2a水平,同时使脾细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13的水平下降,而IFN-r的分泌量增加。研究结果表明,以壳聚糖为佐剂的重组Ara h 2纳米粒进行免疫治疗,能够逆转Th1/Th2反应平衡,产生以Th1为主的免疫应答。因此,重组Ara h 2壳聚糖纳米粒具有抗花生过敏的显著功效。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 综述
• 1.1 前言
• 1.2 花生过敏
• 1.2.1 花生过敏的危害
• 1.2.2 花生主要过敏原及其研究进展
• 1.2.2.1 Ara h 1
• 1.2.2.2 Ara h 2
• 1.2.2.3 Ara h 3
• 1.3 食物过敏的防治
• 1.3.1 经典特异性免疫治疗
• 1.3.2 肽免疫疗法
• 1.3.3 突变过敏原蛋白免疫疗法
• 1.3.4 非特异性的免疫治疗
• 1.3.5 DNA免疫疗法
• 1.3.6 自然疗法
• 1.4 花生过敏的预防及其治疗研究进展
• 1.5 壳聚糖纳米粒疫苗
• 1.5.1 纳米物质
• 1.5.2 壳聚糖
• 1.5.3 制备壳聚糖纳米粒
• 1.5.4 壳聚糖纳米粒疫苗
• 第2章 重组花生Ara h 2蛋白的制备
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌株、质粒
• 2.2.2 工具酶、分子量Marker及主要试剂
• 2.2.3 主要仪器与设备
• 2.2.4 常规培养基及溶液配制
• 2.3 实验方法与步骤
• 2.3.1 Ara h 2重组质粒提取
• 2.3.2 用EcoRI和HindⅢ双酶切Ara h 2重组质粒及pET-32a载体
• 2.3.2.1 Ara h 2重组质粒双酶切
• 2.3.2.2 pET-32a载体双酶切
• 2.3.3 回收双酶切后的DNA片段
• 2.3.4 构建pET-32a-Ara h 2重组质粒
• 2.3.5 大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞的制备
• 2.3.6 连接产物转化感受态细胞
• 2.3.7 pET-32a-Ara h 2重组质粒的鉴定
• 2.3.7.1 pET-32a-Ara h 2重组质粒的提取
• 2.3.7.2 双酶切鉴定
• 2.3.7.3 DNA测序
• 2.3.8 目的基因的原核表达及SDS-PAGE检测
• 2.3.8.1 大肠杆菌E.coli origami感受态细胞的制备
• 2.3.8.2 pET-32a-Ara h 2质粒转化感受态
• 2.3.8.3 目的基因的原核表达
• 2.3.8.4 重组蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.3.9 分离纯化重组蛋白
• 2.3.9.1 超声破碎菌体
• 2.3.9.2 亲和纯化重组蛋白
• 2.3.9.3 透析重组蛋白
• 2.3.9.4 纯化后重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测
• 2.3.9.5 重组蛋白浓度测定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 pET-32a-Ara h 2重组质粒的构建
• 2.4.2 pET-32a-Ara h 2重组质粒的鉴定
• 2.4.2.1 连接产物转化感受态细胞
• 2.4.2.2 质粒提取与限制性内切酶酶切鉴定
• 2.4.3 pET-32a-Ara h 2重组质粒转化E.coli origami感受态细胞
• 2.4.4 重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE检测分析
• 2.4.5 细胞破碎与亲和纯化的SDS-PAGE检测
• 2.4.6 重组Ara h 2的浓度
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 第3章 重组Ara h 2壳聚糖纳米粒的制备
• 3.1 引言
• 3.2 材料与试剂
• 3.3 主要仪器
• 3.4 实验方法与步骤
• 3.4.1 离子交联法制备重组Ara h 2壳聚糖纳米粒（CS-R-Ara h 2）
• 3.4.2 CS-R-Ara h 2包封率和载药量测定
• 3.4.3 CS-R-Ara h 2纳米粒SDS-PAGE电泳检测
• 3.4.4 CS-R-Ara h 2纳米粒外貌形态的SEM电镜检测
• 3.4.5 CS-R-Ara h 2纳米的Western-Blotting鉴定
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 CS-R-Ara h 2纳米粒的包封率（AE）和载药量（LC）
• 3.5.2 CS-R-Ara h 2纳米粒的SDS-PAGE电泳鉴定
• 3.5.3 CS-R-Ara h 2纳米粒的SEM电镜检测结果
• 3.5.4 CS-R-Ara h 2纳米粒的Western-Blotting鉴定
• 3.6 讨论
• 3.7 小结
• 第4章 重组过敏原Ara h 2壳聚糖纳米粒抗过敏反应的实验动物学研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与试剂
• 4.3 主要仪器设备
• 4.4 实验方法与步骤
• 4.4.1 花生粗蛋白的提取
• 4.4.2 CPE的SDS-PAGE电泳分析
• 4.4.3 CPE溶液的蛋白浓度的测定
• 4.4.4 免疫小鼠
• 4.4.5 过敏反应各项指标的检测
• 4.4.5.1 血管通透性的检测
• 4.4.5.2 小鼠血清特异性IgE的Western-Blotting分析
• 4.4.5.3 血浆中组胺的检测
• 4.4.5.4 血清中特异性IgE（sIgE）和特异性IgG2a（sIgG2a）的检测
• 4.4.5.5 细胞因子的检测
• 4.5 数据分析
• 4.6 结果与分析
• 4.6.1 CPE的SDS-PAGE电泳分析
• 4.6.2 CPE的浓度测定
• 4.6.3 血管通透性的检测结果
• 4.6.4 小鼠血清特异性IgE的Western-Blotting分析
• 4.6.5 血浆中组胺含量（ELISA法）
• 4.6.6 血清中特异性IgE（sIgE）和特异性IgG2a（sIgG2a）的检测
• 4.6.7 ELISA法检测Th1和Th2细胞因子水平
• 4.7 讨论
• 4.8 小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 研究展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果