丙型肝炎病毒特异性树突状细胞胞外体的制备及免疫特性研究

论文摘要

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）是引起慢性肝炎的主要病原体,约80%HCV感染者发展为慢性肝炎,并与肝硬化和肝细胞肝癌的发生密切相关,已成为严重的公共卫生问题。然而,迄今尚缺乏有效的治疗措施,疫苗的研制也步履维艰。树突状细胞（dendritic cell,DC）作为诱导固有免疫（innate immune）和适应性免疫（adaptive immune）应答的核心环节,在机体抗病毒免疫应答中发挥着重要作用,由DC分泌的胞外体（dendritic cell exosome, DC-Ex）富集MHC I/II类分子、协同刺激分子、热休克蛋白70等多种生物活性分子于一身,作为细胞功能的使者,以“特洛伊木马”的形式将免疫活化信息传递给其他免疫细胞,发挥特异性免疫效应。因此,选择性地为Ex载荷HCV抗原信息,理论上可以大大提高抗原的免疫原性,从而有效地诱导抗原特异性细胞免疫及体液免疫应答,并建立抗病毒记忆反应,这为制备HCV疫苗提供了一个新的研究策略。基于上述学术假设,结合近年有关HCV研究所获得的信息,本研究对DC-Ex的功能特性进行以下两方面的探讨:1、DC-Ex制备方法的初步建立及分析鉴定①DC-Ex制备方法的初步建立选用永生化的小鼠树突状细胞株DC2.4为研究对象,在尿酸（uric acid,UA）浓度为0.05mmol/L,0.1mmol/L,0.2mmol/L和0.3 mmol/L培养24 h条件下,收集细胞培养上清,捕获ELISA法检测Ex表面特异性标志CD80、CD86的表达率,间接考量Ex产生的动力学水平,探索UA对DC分泌Ex的影响,为制备大量的较高纯度的Ex做准备;基于Ex的大小和密度,本研究对Ex传统分离方法进行改进,把超滤技术引入Ex的制备过程,即应用中空纤维器去除细胞及细胞碎片、Amicon Ultra超滤离心管压缩体积、密度梯度超离心纯化获得DC-Ex提取物。对照组则采用传统的分级分离的制备方法,比较两种方法的优劣。②DC-Ex的分析鉴定应用透射电镜对DC-Ex提取物进行形态学鉴定,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphte- polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和Western blot进行蛋白组成分析。2、HCV特异性DC-Ex诱导的免疫应答反应选用HCV核心蛋白C,体外刺激DC2.4细胞株,获得具有HCV特异性的DC-Ex;把制备的C57BL/6小鼠脾细胞悬液与HCV特异性的DC-Ex共孵育。收集培养上清,酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune assay,ELISA）检测各组培养上清中IL-6、IL-12及IFN-γ的水平,探讨DC-Ex的呈递免疫活化信息、诱导抗原特异性免疫反应的能力。实验结果:1、尿酸是DC分泌Ex的重要调节因素,以剂量依赖方式影响Ex的产量,浓度为0.1 mmol/L时,Ex的产量最高。2、所建立的超滤离心法是一种简便高效的制备Ex的实验方法,获得的DC-Ex在电镜下呈典型的杯状,由脂质双层膜包绕的扁平半球体,直径约60-90 nm,SDS-PAGE带型和文献报道相似,包含有主要的特征性标志物分子MHC I,MHC II,CD80和CD86,与传统分离法相比,超滤离心法耗时少,产量和纯度较高。3、HCV特异性DC-Ex可有效地将免疫活化信息呈递给脾细胞,诱导脾细胞产生较高水平的IL-6、IL-12、IFN-γ。初步实验结论:在尿酸的诱导下,超滤离心法可成功获得较高纯度的Ex,所制备的HCV特异性DC-Ex能有效的将免疫活化信息呈递给其他免疫细胞,诱导抗原特异免疫反应,有可能作为一种新的DC-Ex疫苗用于HCV感染的预防和治疗。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 树突状细胞胞外体制备方法的建立及分析鉴定
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 实验二 丙型肝炎病毒特异性树突状细胞胞外体诱导的疫应答反应
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢