论文摘要
【目的】：1．研究猪苓多糖（polyporus polysaccharide，PPS）协同卡介苗（bacillus calmette guerin，BCG）诱导小鼠腹腔巨噬细胞TLR2、TLR4、CD14、黏附分子及共刺激分子的表达，核转录因子NF-κB的激活，炎症因子的表达，探讨其诱导的免疫应答启动机制。2．研究卡介苗在人膀胱癌细胞株T24中的直接作用部位和对T24超微结构的影响，及猪苓多糖对其的协同作用。【方法】：1．实验分组，每组18只NIH小鼠（26-28g）：①对照组（皮下注射生理盐水0.1ml／只）②BCG组（皮下注射BCG悬液1mg／只）③B+P组（BCG给药同前，同时腹腔注射PPS 2mg／只，）④PPS组（腹腔注射PPS 2mg／只）。分别在给药后2小时，12小时，24小时从每组各抽取6只小鼠，处死后收集小鼠腹腔巨噬细胞。2．应用流式细胞术观察PPS、BCG刺激后小鼠腹腔巨噬细胞TLR2，TLR4，CD14，CD11b，CD40的表达情况。3．用间接荧光法对PPS、BCG免疫后的小鼠腹腔巨噬细胞进行染色，利用激光共聚焦显微镜技术，观察核转录因子NF-κB分子，在胞浆和胞核表达的变化以及其转移的情况。4．运用ELISA技术，检测PPS、BCG免疫后的小鼠腹腔巨噬细胞上清液中IL-1β、IL-12和IL-10，脾脏匀浆液中IL-2和IL-4及外周血清TNF-α的含量。5．用透射电镜和扫描电镜技术观察BCG在T24中的作用部位，对T24超微结构的影响，及PPS的协同作用。6．实验数据使用PEMS 3.0统计分析软件分别进行多个均数比较分析。【结果】：1．PPS协同BCG体内刺激对小鼠腹腔巨噬细胞TLRs表达的影响：（1）PPS组12h巨噬细胞TLR2表达高于对照组（P＜0.05），24h后下降。B+P组2h后TLR2表达高于PPS和BCG单用组（P＜0.05），12h之后下降。（2）PPS组小鼠巨噬细胞TLR4表达在3个时点无明显变化，在12h、24h低于对照组（P＜0.05）。B+P组2h后TLR4表达高于PPS和BCG单用组（P＜0.05）。（3）PPS组小鼠巨噬细胞CD14表达在3个时点无明显变化，在12h、24h低于对照组（P＜0.05）。B+P组2h后CD14表达高于PPS和BCG单用组（P＜0.05），之后下降。2．PPS协同BCG体内刺激对小鼠腹腔巨噬细胞共刺激分子表达的影响：（1）PPS组12h小鼠巨噬细胞CD11b表达高于对照组（P＜0.05），24h后下降。B+P组2h和12h CD11b表达高于PPS和BCG单用组（P＜0.05），之后下降。（2） PPS组小鼠巨噬细胞CD40表达在3个时点无明显变化，在2h、12h低于对照组（P＜0.05）。B+P组2h后CD40表达高于PPS（P＜0.05）。3．PPS协同BCG体内刺激对小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB活化的影响：（1）PPS组NF-κB胞核荧光强度在3个时点内缓慢上升，但均低于对照组（P＜0.05）；B+P组NF-κB胞核荧光强度高于PPS组（P＜0.05），在12h明显增强，与对照组相比差异有统计学意义。（2）PPS组NF-κB胞浆荧光强度在3个时点呈上升趋势，但均低于对照组（P＜0.05）；B+P组NF-κB胞浆荧光强度在2b和12h高于PPS组（P＜0.05），在12h明显增强。（3）PPS组NF-κB核浆荧光强度比在3个时点呈下降趋势，24h低于对照（P＜0.05）；B+P组NF-κB核浆荧光强度比在24h明显上升，高于PPS组和对照组（P＜0.05）。4．PPS协同BCG体内刺激对小鼠腹腔巨噬细胞细胞因子分泌的影响：（1）PPS组2h小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β分泌高于对照组（P＜0.05），B+P组IL-1β分泌低于PPS组，在2h和24h有统计意义（P＜0.05）。（2）PPS组小鼠脾匀浆上清中IL-4含量在3个时点变化不明显，低于对照组，但无统计意义。B+P组IL-4含量与PPS组相近，差异无统计意义。（3）小鼠腹腔巨噬细胞上清中未检测到IL-12，IL-10和脾匀浆液中的IL-2，外周血清的TNF-α。5．BCG对T24的直接作用及形态学观察：BCG组2h细胞表面球状颗粒增多，胞膜不光整，BCG与癌细胞作用24小时，细胞表面微绒毛减少，有的肿胀，长突起大部分消失，小球状结构增多。与PPS联合组细胞表面出现较多粗的突起物。BCG被吞入胞浆或胞核，线粒体肿胀，胞浆胞核物质丢失，细胞呈溶解趋势。综上所述：1．PPS体内单独刺激不能促进TLR分子的表达，联合BCG可产生协同作用并促进TLR分子和CD14的表达。2．PPS协同BCG可以促进黏附分子CD11b分子的表达。3．PPS协同BCG作用24h促使NF-κBp65向核内转移。4．PPS、BCG作用初期（24h）尚不能显著诱导炎症因子的释放。5．BCG对膀胱癌细胞有直接损伤作用，PPS有协同作用。【结论】：猪苓多糖协同卡介苗作用初期能促进巨噬细胞表面CD14、TLR2和TLR4分子，及黏附分子CD11b表达增加，激活NF-κBp65，TLR分子及信号通路可能作为主要途径之一介导PPS和BCG启动机体免疫进而引发抗肿瘤效应。另外，BCG还可以通过直接损伤肿瘤细胞，释放出致炎物，参与免疫启动过程。
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