上海地区副猪嗜血杆菌分子流行病学调查研究及基因组文库的构建

论文摘要

副猪嗜血杆菌（haemoph lius parasuis, HPS）属巴氏杆菌科嗜血杆菌属细菌,为革兰氏阴性,小短杆至长丝状,V因子依赖性非溶血性细菌,是猪上呼吸道的一种常在菌,在一定条件下可引起严重的全身性疾病,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征,该病原引起的疾病又称为革拉氏病（Glasser’s disease）。该菌多与其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染,严重危害了仔猪和青年猪的健康。近年来由于该病的频繁发生,给养猪业带来了严重的损失,因此倍受人们的关注。1.根据副猪嗜血杆菌16S rRNA基因设计了一对引物,通过最佳条件摸索扩增出大小为821bp的特异的目的基因片段,建立了快速检测副猪嗜血杆菌的PCR方法。该方法最低检出量达10-3ng,且对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪多杀性巴氏杆菌等多种常见细菌均无交叉性反应。门诊送检的病料中用该PCR法检测出4株副猪嗜血杆菌,并对分离株SH08-54P的PCR扩增产物进行测序与比对分析,其与已发表的GenBank中的相关菌株的同源性为97.3%-100%。2.2008年2月至2009年5月间从来自于上海地区规模化养殖场、屠宰场和上海市动物疫病预防控制中心门诊的1518份样品中,结合临床特征、HPS的培养特性及形态、染色情况等对其进行了初步鉴定,初步分离了38株副猪嗜血杆菌疑似株。根据HPS 16S rRNA基因设计合成引物建立特异PCR方法并结合生化特性试验从38份样品中分离到24株HPS,总分离率为1.6%（24／1518）,细菌来源主要为上海市动物疫病预防控制中心门诊采集的临床样品,占70.8%（17／24）,其余为猪场日常监测的咽喉拭子及屠宰场猪肺、心等样品。生化试验结果表明,分离株与参考菌株均表现为吲哚、脲酶、山梨糖和甘露醇阴性,葡萄糖、麦芽糖和半乳糖阳性。并对这24株HPS进行药敏实验,结果表明所有分离株对阿奇霉素、头孢拉定、菌必治、先锋必、氧氟沙星和呋喃妥因较为敏感,然而已经对新生霉素、阿米卡星、林可霉素、红霉素和庆大霉素等多种抗生素产生了严重的耐药性,并且有加强的趋势,提醒人们对滥用抗生素所带来的隐患应予足够重视。血清学分型显示分离株以血清5型和血清4型最为流行,所占比例分别为29.2%（7／24）和16.7%（4／24）,其次为血清12、13和14型,其中4株分离株不能进行分型。3.利用稀有限制性位点聚合酶链反应（IRS-PCR）对34株副猪嗜血杆菌进行基因分型研究,扩增出分子量在100-2000bp之间的7-18条清晰的条带,34株菌被成功分为Ⅰ和Ⅱ大类群。10株参考菌株中有8株和1／3的分离株属Ⅰ类群,HS80,HS1075和2／3的分离株属于Ⅱ类群,其中来自于南汇,奉贤和嘉定的所有分离株均属Ⅱ类群,且同源性较高,遗传相关系数大于0.60。IRS-PCR敏感性和稳定性好,具省时省力等优势,是理想的副猪嗜血杆菌基因分型方法。4.选择Sau3AI对HPS上海流行优势菌株SH08-54P不完全酶切获取1-6kb的DNA片段,以pUC18质粒DNA为载体,用BamHI完全酶切、CIAP处理后与上述DNA片段连接构建基因组文库,获得3.89×105个重组克隆子,符合建库要求,随机挑取24个克隆子经PCR鉴定重组率为100%,且插入1kbDNA片段比例为92%,文库构建成功；利用超声波裂解菌液与佐剂混合免疫SPF新西兰大白兔制备抗血清,对用IPTG诱导后的文库进行反复3次免疫筛选,最终获得5个持续阳性克隆子,片段大小分别大约为0.7 kb,1.0 kb,1.1kb,1.8 kb,0.9kb,对其重组子插入片段核苷酸序列测定及同源性分析发现,分别编码假定微球菌核酸酶（热核酸酶）样蛋白；乙酰基转移酶；外膜蛋白A；ABC型Fe3+转运系统通透酶酶成分；UDP-N-乙酰葡糖-烯醇丙酮酰转移酶（MurA酶）,均为HPS非常重要的蛋白成分。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 副猪嗜血杆菌研究进展
• 1 病原学
• 2 临床与病理学特征
• 3 流行病学
• 4 致病因素研究进展
• 4.1 荚膜多糖（CPS）
• 4.2 脂多糖（LPS）
• 4.3 脂寡糖（LOS）
• 4.4 外膜蛋白（OMP）
• 4.5 转铁结合蛋白（TBP）
• 4.6 神经氨酸酶（NA）
• 4.7 生物被膜（BF）
• 4.8 cAMP依赖性自然转化系统
• 4.9 其它
• 5. 分型学研究
• 5.1 血清学分型
• 5.2 分子生物学分型
• 5.2.1 外膜蛋白（OMP）指纹图谱法
• 5.2.2 多位点酶切电泳图谱法（MEE）
• 5.2.3 限制性内切酶酶切指纹图谱法（REF）
• 5.2.4 肠科杆菌基因间重复一致序列PCR（ERIC-PCR）
• 5.2.5 多位点序列分型法（MLST）
• 5.2.6 限制性片段长度多态性PCR分型法（RFLP-PCR）
• 5.2.7 随机扩增多态性DNA分型法（RAPD）
• 5.2.8 Hsp60分型法
• 6. 诊断方法研究进展
• 6.1 免疫组化法诊断
• 6.2 血清学诊断
• 6.3 分子生物学诊断
• 6.3.1 特异寡核苷酸捕获平板杂交（OSCPH）
• 6.3.2 原位杂交（ISH）
• 6.3.3 PCR
• 7. 预防与治疗研究进展
• 7.1 非免疫接种保护
• 7.2 免疫接种保护
• 7.3 药物预防与治疗
• 8. 总结与展望
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第一章 副猪嗜血杆菌PCR诊断方法的建立与临床运用
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 细菌基因组DNA的提取
• 1.2.3 PCR反应条件的摸索
• 1.2.4 特异性试验
• 1.2.5 敏感性试验
• 1.2.6 PCR的临床运用和序列测定与比对
• 2. 结果
• 2.1 PCR反应条件的优化
• 2.2 PCR特异性测定
• 2.3 PCR敏感性测定
• 2.4 PCR的临床运用和序列测定与比对
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第二章 上海地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及血清学调查
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 样品的采集及细菌的分离
• 1.2.2 形态学鉴定
• 1.2.3 培养特性鉴定
• 1.2.4 PCR检测
• 1.2.5 生化试验
• 1.2.6 药敏试验
• 1.2.7 兔抗标准血清的制备
• 1.2.8 琼脂扩散分型抗原的制备
• 1.2.9 琼脂扩散试验血清学分型
• 2 结果
• 2.1 分离菌的形态学特性
• 2.2 分离菌的培养特性
• 2.3 PCR检测结果
• 2.4 分离菌株的生化特性鉴定
• 2.5 药敏试验结果
• 2.6 分离菌株的血清型鉴别
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 IRS-PCR在副猪嗜血杆菌基因分型研究中的应用
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 基因组DNA的制备
• 1.2.3 连接体的制备
• 1.2.4 双酶切及DNA连接
• 1.2.5 IRS-PCR
• 1.2.6 HPS分离株IRS-PCR及遗传相关性分析
• 2 结论
• 2.1 HPS IRS-PCR扩增结果
• 2.2 HPS分离株IRS-PCR遗传相关性分析
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第四章 副猪嗜血杆菌基因组文库的构建及抗原肽的筛选
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 质粒和菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 实验动物
• 1.1.4 仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌基因组文库的建立
• 1.2.2 基因组文库的免疫学筛选
• 2. 结果
• 2.1 SH08-54P基因组的提取
• 2.2 最佳酶切条件的确定
• 2.3 载体质粒pUC18的准备
• 2.4 DNA酶切片段与载体重组及PCR鉴定
• 2.5 库容量确定
• 2.6 基因组文库的免疫学筛选
• 2.6.1 阳性克隆子的获得
• 2.6.2 阳性克隆子插入片段大小的鉴定
• 2.6.3 重组子插入片段核苷酸序列测定及同源性分析
• 3. 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的主要论文