论文摘要
皮肤缺损的修复是外科系统常见临床问题。脱细胞真皮基质（acellulardermal matrix,ADM）作为一种新型的真皮替代物,最初用于皮肤缺损的修复,现已被应用于神经外科、耳鼻咽喉、烧伤整形、牙周等领域。但对于ADM在体内的改建规律和远期变化,国内外存在较大争议。本研究采用Dispase-Triton法制备脱细胞真皮基质,异体移植于大鼠体内,观察其生物学变化。实验目的:探讨脱细胞真皮基质在体内的改建规律。实验方法:第一部分:制备ADM和异体真皮。选用成年雄性Wistar大鼠8只,处死后于脊柱两侧脱毛备皮。切取大鼠背部全层皮肤（4×4cm）,用鼓式取皮机反取厚约0.6mm的皮层,再分剪成2×2cm皮片,共32片。皮片随机分成两组,每组16片,分别放入2.5U/ml Dispase（4℃）和1M/L NaCI溶液（常温）48h,脱去表皮层,再分别投入0.5%Triton X-100溶液48h和0.5%SDS溶液6h,常温振荡脱去细胞。取材,采用组织学和分子生物学方法检测所制备的ADM的优劣。另选同性质大鼠4只,取皮后的皮片仅采用Dispase脱去表皮层制备异体真皮。第二部分:建立动物模型。选用成年雄性Wistar大鼠16只,随机分为ADM组8只,异体真皮8只。在上背部脊柱左侧作与脊柱平行的直切口,长约2cm,切口的两端分别向远心端45°延伸0.5cm,使切口呈梯形。切开皮肤全层及皮肌,直达深筋膜表面,钝性分离,形成足够空间。将制备好的ADM（2.0cm×2.0cm）填入腔隙,展平,四角用0号丝线固定于筋膜上。将皮瓣覆盖ADM,间断原位缝合,上盖无菌凡士林纱布和干纱布,外用胶布和绷带可靠固定。术后3d、1、2、4w切取标本,观察模型稳定性。同样方法移植异体真皮。第三部分:ADM和异体真皮转归研究。选用成年雄性Wistar大鼠112只,14只用于制备ADM（Dispase-Triton法）,14只制备异体真皮。剩余84只随机分为两组:ADM实验组42只,异体真皮对照组42只。采用上述回植模型,移植ADM和异体真皮。于术后1、2、3、4w、2、4、6M杀死动物,取材。做常规HE染色和苦味酸-天狼星红胶原特异染色,同时检测胶原蛋白总量（羟脯氨酸OHP）,并采用免疫组化方法检测基质金属蛋白酶-1的含量。分析不同时间点ADM和异体真皮厚度、胶原蛋白总量、Ⅰ/Ⅲ胶原比例、MMP-1活性和成纤维细胞计数的变化规律。实验结果:第一部分:采用Dispase-Triton法制备的ADM完全去除了细胞成分,胶原排列维持正常,Ⅰ/Ⅲ胶原比例于正常皮肤相比没有差异;NaCl-SDS法制备的ADM含有较多的细胞成分,Ⅰ/Ⅲ胶原比例高于正常皮肤。第二部分:移植ADM术后3d、1、2、4w,均见ADM平展于腔隙内,无皱褶、无明显渗出,并且与周边组织逐渐愈着;镜下见成纤维细胞数量渐增多,2w达到高峰,4w明显减少,未见到有明显的炎症细胞。移植异体真皮3d、1、2w均有明显的渗出液,异体真皮平展于腔隙内,周围组织有明显炎性反应,4w时渗出液基本消失;镜下见到大量炎细胞始终存在,并出现成纤维细胞。第二部分:（1）成纤维细胞计数:ADM和异体真皮均在2w时最多（ADM高于异体真皮）,此后呈下降趋势;异体真皮下降幅度较小,4w以后细胞计数多于ADM。二者在所有时间点差异均有统计学意义（P＜0.05）。（2）Ⅰ/Ⅲ胶原比例:二者比例在4w前一直下降,无明显差异（P＞0.05）;4w后异体真皮的比例逐渐升高,ADM保持不变,二者相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。（3）OHP含量:4w时ADM的OHP含量最高,后逐渐下降至0点;异体真皮OHP含量先于1w时下降,后上升,4w时最高,而后呈持续下降趋势。二者在所有时间点差异均有统计学意义（P＜0.05）。（4）MMP-1活性:MMP-1表达于成纤维细胞胞浆内。3w时ADM内MMP-1活性最高,后逐渐下降至0点水平;异体真皮酶活性4w最高,后缓慢下降,但始终高于ADM。除4w外,二者在其余时间点相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验结论:1.采用Dispase-Triton法制备的ADM优于NaCl-SDS法制备的ADM。2.异体移植动物模型可保证ADM在稳定的环境中参与机体改建。3.ADM能与机体融合,参与正常的改建,异体移植4w后胶原合成和降解基本达到平衡,其后保持长时间的稳定性,具有较大临床应用价值。异体真皮的胶原纤维持续性降解,导致胶原网架最终解体。4.成纤维细胞在ADM的改建中起到基础和主要的作用。
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