不同结构荒漠昆虫抗冻蛋白表达及其活性比较

论文摘要

抗冻蛋白（antifreeze proteins, AFPs）是一类可以抑制冰晶生长的功能性生物大分子,它能以非依数性形式降低溶液的冰点而不影响其熔点,从而导致溶液冰点和熔点的差异,这种差异称为抗冻活性或热滞活性（thermal hysteresis activity, THA）。AFPs作用于冰晶或是冰核的表面而抑制它们的生长。根据它这一特性,生物有机体可以避过严寒天气所带来的伤害。这类蛋白分布于多种生物有机体内,包括植物、细菌、真菌、鱼类和昆虫。其中昆虫AFP具有很高的抗冻活性,是鱼类抗冻蛋白的10-100倍,这与昆虫抗冻蛋白的特殊结构是密切相关的。本研究首先对戈壁琵琶甲（Blaps kashgarensis）抗冻蛋白基因Bkafp972在大肠杆菌中进行表达,获得可溶性融合蛋白MBP-BkAFP972。用纯化后的MBP-BkAFP972对大肠杆菌进行低温保护实验和小鼠肌肉的低温冻存实验,结果表明,用基因工程方法得到的融合蛋白MBP-BkAFP972具有了很好的抗冻保护效果,即说明通过原核表达系统得到的新疆荒漠昆虫AFPs,仍具有很好的生物活性,由此可解决抗冻蛋白推广应用时的来源问题。为了探讨蛋白标签大小对融合抗冻蛋白活性的影响,比较两种不同昆虫准噶尔小胸鳖甲（Microdera punctipennis）和戈壁琵琶甲（Blaps kashgarensis）的抗冻蛋白及其不同融合表达标签GST和MBP融合表达后的生物学活性和热滞活性。发现准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP5的两种融合蛋白相对于戈壁琵琶甲抗冻蛋白BkAFP972的两种融合蛋白的抗冻活性和热滞活性都要强。从蛋白结构上分析,两种昆虫的AFP都具有典型的十二个氨基酸重复TCTxSxxCxxAx序列,不同的是MpAFP5比BkAFP972多出一个重复单位,在三级结构上多一个螺旋环,由此推断螺旋环的个数对抗冻蛋白的抗冻活性有重要作用。此外,研究也发现带有MBP标签的融合AFP比带有GST融合标签的活性要高,纯化出的重组蛋白的溶质结构比较单一。为消除标签蛋白对AFP活性的影响,用凝血酶切除GST-MpAFP5和GST-BkAFP972上的GST标签之后,发现MpAFP5和BkAFP972的活性都比重组蛋白的活性高,且MpAFP5的活性仍比BkAFP972强。为进一步探讨螺旋环数对昆虫AFP活性的影响,根据Mpafp5的基因序列,设计引物,通过PCR技术将MpAFP5三级结构的第5个螺旋环突变去除,再将突变后的基因（命名为:sMpafp5）构建到两种原核表达载体上,并对pGEX4T-1-sMpafp5、pMAL-p2x-sMpafp5进行诱导表达,纯化出GST-sMpAFP5、MBP-sMpAFP5融合蛋白,通过与未突变的MpAFP5融合蛋白的THA比较,结果证明具有8个重复螺旋环的MpAFP5融合蛋白比具有7个螺旋环的sMpAFP5融合蛋白THA要高,此研究证明出螺旋环的个数对昆虫AFPs的抗冻活性起着有重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略语
• 第一部分 文献综述
• 1 抗冻蛋白的结构
• 1.1 鱼类抗冻蛋白的结构特征
• 1.2 植物抗冻蛋白的结构特征
• 1.3 昆虫抗冻蛋白的结构特征
• 2 抗冻蛋白活性
• 参考文献
• 第二部分 实验内容
• 第一章 戈壁琵琶甲抗冻蛋白（BKAFP972）原核表达产物的纯化及功能检测
• 1 材料及主要试剂
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 其它材料及试剂
• 2 方法
• 2.1 融合抗冻蛋白基因的表达
• 2.2 融合抗冻蛋白的纯化
• 2.3 抗冻蛋白对细菌的低温保护
• 2.4 小鼠肌肉的石蜡切片制作
• 3 结果
• 3.1 融合抗冻蛋白基因的表达
• 3.2 融合抗冻蛋白的纯化
• 3.3 AFPs 对细菌的低温保护分析
• 3.4 AFPs 对哺乳动物肌肉组织的低温保护效果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二章 戈壁琵琶甲与准噶尔小胸鳖甲基因原核表达抗冻蛋白的活性比较
• 1 材料及主要试剂
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 其它材料及试剂
• 2 方法
• 2.1 抗冻蛋白基因的表达
• 2.2 抗冻蛋白的纯化
• 2.3 抗冻蛋白的热滞活性测定
• 2.4 抗冻蛋白的热稳定性测定
• 2.5 抗冻蛋白对细菌的低温保护
• 2.6 蛋白溶液的冰晶形态的观察
• 2.7 MpAFP5 与 BkAFP972 的 THA 比较
• 3 结果
• 3.1 MBP-MpAFP5、GST-MpAFP5、MBP-BkAFP972 和 GST-BkAFP972 的可溶 性表达
• 3.2 MBP-MpAFP5、GST-MpAFP5、MBP-BkAFP972 和 GST-BkAFP972 的纯化
• 3.3 融合抗冻蛋白的热滞活性和热稳定性
• 3.4 AFP 对溶液冰晶形态的影响
• 3.5 融合AFP 对细菌的低温保护分析
• 3.6 MpAFP5 与 BkAFP972 THA 的比较
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 准噶尔小胸鳖甲融合抗冻蛋白结构对功能的影响
• 1 材料及主要试剂
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 突变产物sMpafp5基因的突变与测序
• 2.3 构建突变产物sMpafp5基因原核表达载体酶切鉴定
• 2.4 突变产物 sMpafp5 基因原核表达产物的 SDS-PAGE 鉴定及纯化
• 2.5 异构体融合抗冻蛋白THA 的测定
• 3 结果
• 3.1 抗冻蛋白基因片段的PCR 扩增
• 3.2 突变测序结果分析
• 3.3 原核表达重组质粒 pGEX4T-1-sMpafp5、 pMAL-p2x-sMpafp5 的酶切鉴定
• 3.4 突变产物 sMpafp5 基因原核表达产物的 SDS-PAGE 鉴定及纯化
• 3.5 异构体融合抗冻蛋白THA 活性检测
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三部分 结论与展望
• 致谢
• 个人简历