转p～（35）基因昆虫细胞系的研究

论文摘要

昆虫细胞作为重组病毒的表达载体能成功高效地表达外源基因,生产具有重要医用价值、具备天然活性的生物工程制品,因此昆虫细胞培养倍受青睐。目前, 可通过转基因的方法改良现有细胞,从而获得高产昆虫杆状病毒和外源蛋白的昆虫细胞系。本研究是利用构建的转P35 基因工程细胞系,G418 筛选、经单细胞克隆,共得到转P35 基因细胞克隆株45 株,又通过细胞传代选出克隆株37 株。这37 株细胞系分别经PBS、AMD 处理,病毒滴度和多角体产量比较筛选出10 个克隆株: TN5B—1—1、Tn5B—1—8、Tn5B—1—10、Tn5B—1—15、Tn5B—1—16、Tn5B—1—19、Tn5B—1—21、Tn5B—1—27、Tn5B—1—31、Tn5B—1—33。10 株细胞分别接种昆虫病毒TnGV、TnNPV、MsNPV、PiNPV、AcMNPV,其中仅Tn5B—1—8 对所测的所有NPV 病毒敏感,即命名为Tn5B—P35（简写为Tn5B—35）。Tn5B—35 细胞形态主要为纺锤形和圆形,贴壁生长,大小为18.2×41。0 μm。增殖很快,群体倍增时间为22.27h,最大生长密度可达2.14×106cells/mL。对AcMNPv 病毒感染率达95%,多角体产量平均为115 OBs/cell。Tn5B—35 有较强的营养抗逆性,细胞在无营养的PBS 盐缓冲液中1d 以后,Tn5B—35 细胞有86%存活, 比野生型TIa5B1—4 细胞高出24%,第5d 时,Tn5B1—4 细胞全部死亡,Tn5B—35 第5d 仍然有42%存活细胞。用含不同浓度放线菌素D 的培养基处理Tn5B—35 细胞lh, 当放线菌素D 浓度为0.3l,0.62,1.25 和2.5 μg/mL 时,Tn5B—35 细胞的存活率分别比Tn5B1—4 高出37%,55%,65%和68%,当浓度高达5 μg/mL 时,Tn5B1—4细胞全部死亡而Tn5B—35 细胞仍有52%的生存率。说明此细胞具有抗凋亡的特性。昆虫病毒AcMNPV 在Tn5B—35 细胞中离体传代25 次,病毒未出现传代效应, 其病毒滴度、多角体形态及产量、杀虫毒力均无明显变化。Tna5B—35 细胞是昆虫杆状病毒离体复制的优良细胞系。我们对Tna5B—35 细胞的基因组进行PCR 鉴定,结果表明Tn51—4 基因组DNA 经PCR 检测没有出现预期的带,而转化细胞Tn5B—35 的基因组DNA 的PCR 扩增, 出现了预期的一条0.7kb 的带,与重组质粒pIZ/V5.His/p35 的扩增分子大小相同, 证明转化细胞Tn5B—35 含有P35 基因,即重组质粒pIZ/V5 一His/p35 已经整合到细胞的染色体上。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 昆虫细胞培养的发展历史和研究现状
• 1.1.1 昆虫细胞培养基
• 1.1.2 昆虫细胞系的建立
• 1.1.3 昆虫细胞-杆状病毒表达系统
• 1.1.4 构建基因工程细胞系
• 1.2 昆虫细胞的应用
• 1.2.1 基础研究
• 1.2.2 开发医用疫苗和药物
• 1.2.3 农牧业应用
• 1.3 前景展望
• 1.4 立题依据及目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 昆虫细胞系
• 2.1.2 昆虫细胞培养基
• 2.1.3 供试昆虫与病毒
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 培养基的配制
• 2.2.2 人工饲料的配制
• 2.2.3 甜菜夜蛾的饲养
• 2.2.4 细胞培养方法
• 2.2.5 细胞克隆
• 2.2.6 细胞克隆株筛选
• 2.2.6.1 细胞传代
• 2.2.6.2 生物学特性测定
• 2.2.7 Tn5B-40细胞克隆株生物学特性测定
• 2.2.7.1 形态特征
• 2.2.7.2 细胞生长曲线测定
• 2.2.7.3 AcMNPV多角体产量测定
• 2.2.7.4 营养抗逆性测定
• 2.2.7.5 AMD抗性测定
• 2.2.7.6 病毒的离体传代
• 2.2.8 目的基因p的PCR鉴定
• 2.2.8.1 细胞DNA的提取
• 2.2.8.2 引物设计
• 2.2.8.3 PCR检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 转基因细胞可隆株的获得和初筛
• 3.2 细胞克隆株的筛选
• 3.2.1 抗性筛选
• 3.2.2 AcMNPV病毒滴度及多角体产量比较
• 50值'>3.2.2.1 毒源的TCID₅₀值
• 3.2.2.2 病毒滴度及多角体产量比较
• 3.2.3 病毒敏感性比较
• 3.3 Tn5B-35生物学特性测定
• 3.3.1 细胞形态观察
• 3.3.2 细胞生长曲线
• 3.3.3 AcMNPV多角体产量测定
• 3.3.4 营养抗逆性
• 3.3.5 AMD抗性
• 3.3.6 病毒的离体传代
• 3.3.6.1 病毒感染率的测定
• 3.3.6.2 多角体产量的测定
• 3.3.6.3 病毒50%组织培养感染剂量（TCID）的测定
• 3.3.6.4 连续传代的AcMNPV病毒对甜菜夜蛾幼虫的毒力测定
• 35的PCR鉴定'>3.4 目的基因p³⁵的PCR鉴定
• 第四章 讨论
• 第五章 小结
• 参考文献
• 附图
• 作者简介
• 致谢