论文摘要
随着医学水平的不断提高,人们将越来越多的关注投注于神经系统各种疾病的治疗上,而由于神经系统的特殊性,目前我们对神经系统的工作机制、发病机理仍不能完全掌握,临床上也缺乏对神经系统疾病的有效治疗措施。构成神经系统结构和功能的基本单位是神经元,又称神经细胞。神经系统众多疾病的病理特征之一表现为神经元的死亡。细胞在受到损伤后,会促进或抑制一系列基因的转录,其中可能包括那些参与维持细胞稳态和修复细胞的基因,最终导致细胞的修复或者死亡。细胞凋亡在机体发育和对外界刺激反应的过程中起着非常重要的作用,正常生理情况下各类神经元处于平衡状态,如果神经元在外界刺激的作用下发生异常,大量死亡丢失,则很有可能导致病变,如神经退行性疾病帕金森病、阿尔兹海默病等。这些疾病的共同病理特征为神经元丢失。因为神经退行性疾病的发病机制不明,目前的治疗主要是对症治疗,临床上仍缺乏疗效好、副作用少的治疗方法。虽然目前已知神经退行性疾病和基因突变及环境毒素有关,但是神经元变性、死亡的分子机制仍然不明,如能阐明神经元死亡的分子机制,则能够更好地寻找有效的防治方法。在内外毒性因素刺激时,神经元内促进细胞存活的机制被激活,其中基因转录依赖的存活机制非常重要。而组蛋白去乙酰化酶是一类可以使组蛋白N端乙酰化的赖氨酸上脱去乙酰基团的酶,是维持染色体的基本组成单位核小体中组蛋白乙酰化平衡的关键酶类之一,其催化组蛋白的去乙酰化作用,与基因转录抑制密切相关,牵涉到促基因沉默的诸多过程。在细胞染色质水平、通过诱导组蛋白去乙酰化来调控包括染色质重组、转录活化或抑制、细胞周期、细胞分化、细胞存活及细胞凋亡等一系列生物学效应。Sirtuin蛋白是III类组蛋白去乙酰化酶,是一类具有NAD+依赖性的组蛋白去乙酰基转移酶,包括最初被发现于酵母细胞中的Sir2以及存在于哺乳动物中的同源类似物SIRT1-SIRT7。它们都包含保守的C端催化结构域,但在N末端与C末端的序列有所不同,它们有着不同的亚细胞定位,显示出不同的生物功能。大量研究证实Sirtuin具有广泛的生理功能,在调控衰老和寿命方面发挥重要的作用。SIRT2是Sirtuin家族中唯一优先定位在胞浆的成员,但同时SIRT2也与细胞核内的调节有关。研究表明,SIRT2可以对Hinstone H4进行去乙酰化。同时有研究表明,加入SIRT2的抑制剂能够对帕金森模型有保护作用。而目前的研究表明组蛋白去乙酰化酶可以受到蛋白激酶的调控,从而影响细胞的染色质重组、转录活化或抑制、细胞周期、细胞分化及细胞凋亡等。蛋白激酶（protein kinases）,是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。蛋白激酶在细胞内的分布遍及胞核、线粒体、微粒体和胞浆。蛋白质磷酸化反应是指由酶催化三磷酸腺苷（即ATP）上的磷酸基团转移到底物蛋白质的特定氨基上所进行的共价修饰的一类反应。一般由蛋白激酶催化磷酸化反应中接受磷酸基的部位是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的羟基,也有一些作用于其他基团的激酶,如组氨酸激酶作用于组氨酸残基。研究发现,CDK5、GSK3β与神经退行性疾病密切相关。已有报道,阿尔兹海默病（AD）情况下CDK5的调节亚基p35的异常引起tau蛋白磷酸化和堆积。Tau蛋白可被CDK5直接磷酸化,同时CDK5也可间接调控作用于Tau蛋白的激酶或磷酸酶而发挥作用。CDK5活性失调或异常分布均对神经元有毒害作用,并可能导致一些神经退行性疾病的发生。经研究表明,在发育神经元中,SIRT2被CDK5磷酸化,其活性降低,影响细胞的黏附和迁移,调节神经突起的生长。细胞内另一个重要的蛋白激酶是糖原合成酶激酶3β（Glycogen synthase kinase3β,GSK3β）。GSK3β是参与肝糖代谢的关键酶。GSK3β通过影响血液中葡萄糖的浓度,还可影响线粒体渗透性及转录因子,参与细胞凋亡的调控。GSK3β可通过调节糖原合成酶、原癌基因编码蛋白,以及参与胞内经典的信号通路如参与K基因结合核因子（nuclear factor-κB,NF-κB）通路等方式调控癌细胞的分化、增殖与凋亡,参与细胞骨架动态性的调节。研究表明,在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢嘧啶（MPTP）诱导的神经毒性帕金森病小鼠模型中,激活GSK3β可以诱导DA能神经元凋亡；而抑制GSK3β的活性不仅可以保护DA能神经元,减少MPTP诱导的凋亡,还能恢复MPTP导致的DA损耗,减轻行为障碍。已有报道在AD中GSK3β与CDK5共调节Tau蛋白,那么GSK3β与CDK5会有其他的共同调节的底物吗?在PD中是否存在着GSK3β与CDK5共调节某一个蛋白的可能呢?PD一个重要的病理特征是Lewy小体,而Lewy小体的主要成分是a-synuclein,有研究表明SIRT2抑制剂对a-synuclein引起的细胞毒性和帕金森模型有一定的保护作用,而CDK5已知可对SIRT2进行磷酸化,且我们发现SIRT2氨基酸序列上存在着符合GSK3p与CDK5的识别位点的可能的磷酸化位点,那么SIRT2有没有可能也是可以被GSK3β与CDK5共调节呢?又或者GSK3β可能在被其他酶类激活以后能对SIRT2有作用呢?我们通过线索分析了细胞内可能参与调控SIRT2的蛋白,初步选定了GSK3β和CDK5两个激酶作为我们的研究对象。因为CDK5已有报道能作用于SIRT2,所以我们首先想要确定GSK3β与SIRT2之间是否存在关系。以此为目的我们构建了用于在细菌内诱导表达SIRT2蛋白的质粒,然后将表达的SIRT2蛋白进行了纯化。纯化后的SIRT2用以进行体外的磷酸激酶实验。用Pro-Q染色检测进行磷酸激酶实验的SIRT2的磷酸化水平的变化后我们发现SIRT2被磷酸化的水平升高,表明SIRT2是能与GSK3β在体外发生磷酸化反应的。但实验中我们发现Pro-Q染色方法灵敏度仍不够高,所以我们选择了更加灵敏更加有针对性的同位素标记法进行下一步的实验。在进行磷酸化反应时加入含有γ-[32P]ATP的ATP反应液,反应中激酶对SIRT2的磷酸化需要利用ATP提供的磷酸基团,通过磷酸化作用,ATPy位上的磷酸基团会被转移到底物上,那么我们就可以通过检测SIRT2上含γ-[32P]ATP的多少来反应SIRT2在体外磷酸化实验中的被磷酸化程度。通过这个实验,我们发现GSK3β与CDK5两个激酶分别都能对SIRT2进行磷酸化,且如果在同一管中同时加入GSK3β和CDK5与SIRT2进行反应,则SIRT2的磷酸化程度增强,这提示我们GSK3β和CDK5同时与SIRT2反应时可能存在一种能够增加磷酸化的调控。我们将进行体外磷酸激酶反应中与GSK3β反应的SIRT2蛋白利用SDS-PAGE凝胶回收后,进行了磷酸化质谱,检测出了SIRT2上可能被磷酸化的位点,那么这些位点是否真的能够被GSK3β磷酸化呢?结合SIRT2的氨基酸序列与得到的磷酸化位点结果进行分析,发现SIRT2的氨基酸序列上有一段序列已知能被CDK5识别,但其也有可能在被CDK5磷酸化后再被GSK3β识别。所以我们将这段序列上可能被磷酸化的位点进行点突变,再进行磷酸化实验,发现SIRT2被GSK3β磷酸化的程度减弱,这提示了我们GSK3β在SIRT2上的此段序列中存在磷酸化位点。我们实验得知GSK3β与SIRT2可以在体外发生磷酸化反应,那么在细胞里这两者是否也有相互作用呢?为了进一步确认GSK3β能否与SIRT2在细胞内有相互作用,我们尝试在HEK293细胞中共转染表达HA-GSK3p与SIRT2-FLAG的质粒,然后通过免疫沉淀的方法,能否把GSK3β与SIRT2的复合物从裂解液中提取出来。如果能提取出二者之间的复合物的话,那么我们就能通过这个方法证明在细胞内GSK3P与SIRT2是有相互作用的。我们利用FLAG抗体结合SIRT2-FLAG蛋白进行免疫沉淀,发现SIRT2-FLAG蛋白能与HA-GSK3p与共沉淀。利用HA抗体结合HA-GSK3p蛋白进行免疫沉淀,发现HA-GSK3p能与SIRT2-FLAG蛋白共沉淀。以上说明细胞内二者之间有结合。而在神经元中,SIRT2的作用是什么呢?SIRT2的量的变化对神经元有着什么样的影响昵?我们尝试在神经元中分别转染phMGFP与phMGFP-SIRT2,以观察过表达SIRT2对神经元的存活的影响。我们发现转染phMGFP-SIRT2组比转染phMGFP组的神经元的存活率要低,荧光拍照后对转染细胞进行了存活率的统计,计算得P=0.04<0.05。即转染phMGFP-SIRT2组与phMGFP组有统计学差异。所以神经元内过表达SIRT2会导致细胞死亡。SIRT2增多引起的细胞死亡是否与GSK3β有关呢?是否是GSK3β对SIRT2的作用使SIRT2的活性改变引起的细胞死亡呢?这些将在我们的下一步实验中得到证明。通过我们的研究,结果将提示我们GSK3β与CDK5能作用于SIRT2的哪些位点,GSK3β与CDK5会否共同调节SIRT2的磷酸化。这将为我们弄清SIRT2在细胞内的调控机制提供了更丰富的信息,更明确的线索,有助于我们进一步掌握神经系统的工作机制、发病机理,早日找到良好的对神经退行性疾病的治疗靶点,更好地寻找有效的防治方法
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标签：组蛋白去乙酰化酶论文; 蛋白激酶论文; 细胞凋亡论文;