梯度材料骨髓间充质干细胞构建组织工程骨—软骨的研究

论文摘要

目的：本实验旨在应用组织工程原理和技术，利用PLA、壳聚糖、胶原研制三维多孔、双性能的骨．软骨复合梯度支架材料；探讨材料的生物相容性、体内降解性能，以及材料对细胞生长可能产生的作用；并进行体外组织工程骨-软骨构建和生物体内原位骨-软骨诱导再生研究。 方法：借助超临界二氧化碳循环法研制壳聚糖生物／聚乳酸／胶原三元多孔复合梯度支架材料，构建不同强度、不同孔径和孔隙率的梯度材料：对支架材料进行动物体内生物相容性和降解试验；采用全骨髓分离培养法，体外进行兔骨髓基质干细胞（BMSC）诱导转化为软骨细胞，并与梯度材料共同培养，构建带骨支架的软骨复合体；将复合体植入新西兰兔体内，原位诱导骨．软骨再生，修复关节软骨缺损。对实验结果进行组织学、免疫组化、超微结构等检测。 结果：1、SC-CO2反复循环法制备的PLA／壳聚糖／胶原的梯度支架材料的具有明显的梯度结构，支架材料的开孔率可以比传统的一次性升压法明显提高，其孔隙结构与孔隙率适宜软骨细胞的种植；梯度材料的生物力学强度、孔隙率、孔径达到了软骨细胞体外生长和体内原位再生的要求；2、全骨髓分离培养法在体外完成了兔MSCs的分离、扩增、传代，MSCs体外诱导向软骨细胞诱导分离3周后，培养出软骨组织块，经HE、Alcian blue染色，可见软骨细胞扩增、传代，并有细胞外基质分泌；免疫组化检测提供了依据，RT-PCR显示有Ⅱ型和Ⅹ型胶原表达，提示细胞所分泌的基质为Ⅱ型胶原，分泌物形成了透明软骨。透射电镜见软骨细胞在材料内呈贴壁生长，基质大量分泌，兔骨髓基质干细胞体在软骨诱导剂和离心培养条件下可成功生成软骨组织，初步构建成功带骨支架的软骨细胞复合体；3、PLA／壳聚糖／胶原支架材料体内组织学观察发现，降解的材料周围可见少量炎症细胞，表明PLA／壳聚糖／胶原在体内的降解产物可能引起轻度的炎症反应，但对组织工程骨软骨的生长发育无明显抑制。组织炎症12周后，基本消失；提示材料组织相容性能良好；4、超微结构显示，细胞在支架材料孔隙内壁良好的附着、生长、扩增并形成软骨样组织，细胞分布均匀，提示体外三维培养的细胞-支架复合物能形成了软骨样组织；5、细胞-支架复合物植入同种异体新西兰兔股骨髁12周后，骨和软骨两部分整合为一个整体，形成了结合良好的

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 第一节 组织工程简介
• 第二节 组织工程学的研究内容及其研究现状
• 2.1 种子细胞
• 2.2 支架材料的研究
• 2.3 组织工程化组织的构建
• 第三节 立题背景与课题的提出
• 3.1 立题背景
• 3.2 课题的提出
• 参考文献:
• 2反复循环萃取法制备梯度材料'>第二章 SC-CO₂反复循环萃取法制备梯度材料
• 第一节 引言
• 1.1 超临界流体技术简介
• 2应用于制备多孔支架材料的原理与发展现状'>1.2 超临界CO₂应用于制备多孔支架材料的原理与发展现状
• 1.2.1 原理
• 2制备多孔支架材料的发展现状及前景'>1.2.2 超临界CO₂制备多孔支架材料的发展现状及前景
• 第二节 梯度材料的制备与性能
• 2.1 主要仪器设备与实验原料
• 2.1.1 主要实验设备
• 2.1.2 主要实验原料
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 双层梯度材料制作过程:
• 2.2.2 材料的扫描电子显微镜（SEM）观察
• 2.2.3 材料的孔率测试
• 2.2.4 材料压缩模量和压缩强度测试
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 梯度材料的SEM观察
• 2.3.1.1 梯度材料的大体形貌观察
• 2.3.1.2 不同层面材料的形态的观察
• 2.3.2 总孔隙率和开孔/闭孔率的测定
• 2.3.2.1 不同壳聚糖比例对孔隙率的影响
• 2.3.2.2 不同胶原含量对孔隙率的影响
• 2.3.3 压缩模量及压缩强度测试
• 2.3.3.1 不同壳聚糖比例对压缩模量及压缩强度的影响
• 2.3.3.2 不同胶原比例对压缩模量及压缩强度的影响
• 第三节 本章小结
• 参考文献
• 第三章 骨髓基质干细胞体外定向诱导培养软骨细胞
• 第一节 引言
• 1.1 骨髓间充质干细胞简介
• 1.2 骨髓间充质干细胞的分离与培养
• 1.3 BMSC的临床应用前景
• 第二节 骨髓基质干细胞体外定向诱导培养
• 2.1 主要试剂和仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 兔骨髓MSCs的分离和原代培养
• 2.2.2 兔骨髓MSCs的传代培养
• 2.2.3 兔骨髓MSCs细胞表面分子检测
• 2.2.4 体外诱导MSCs向软骨细胞分化
• 2.2.5 RT—PCR分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 倒置显微镜形态学观察
• 2.3.2 软骨组织培养
• 2.3.3 软骨细胞诱导
• 2.4 结论与讨论
• 参考文献
• 第四章 体外人工骨/软骨构建
• 第一节 引言
• 第二节 软骨体外立体、定型培养
• 2.1 主要材料
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 细胞支架复合物体外培养
• 2.2.2 组织工程软骨的构建:
• 2.2.3 扫描电镜观察
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 病理检测:
• 2.3.2 电子显微镜检查:
• 2.4 讨论与结论
• 2.4.1 三维梯度支架体外诱导软骨细胞生长
• 2.4.2 MSCs为种子细胞与支架材料构建组织工程软骨:
• 2.4.3 小结
• 参考文献
• 第五章 动物体内试验
• 第一节 引言
• 第二节 梯度材料生物相容性实验
• 2.1 主要实验材料和动物
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 肌肉和皮下植入试验
• 2.2.2 动物的饲养
• 2.3 结果
• 2.3.1 材料肌肉内埋植,
• 2.3.2.材料的皮下植入实验
• 2.4 结论与讨论
• 第三节 梯度材料生物体内降解实验
• 3.1 主要实验材料和动物
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 手术操作
• 3.2.2 动物的饲养
• 3.2.3 检测:
• 3.3 结果
• 3.4 结论与讨论
• 第四节 人工骨/软骨修复兔关节软骨缺损
• 4.1 主要实验材料与实验动物
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验分组:
• 4.2.2 细胞/载体材料复合物的植入:
• 4.2.3 动物的饲养
• 4.2.4 检测:
• 4.3 结果
• 4.3.1 手术取材大体观察:
• 4.3.2 组织学观察
• 4.3.3 X光检查
• 4.4 结论与讨论
• 参考文献
• 第六章、全文小结
• 6.1 本研究主要结论:
• 6.2 问题与展望
• 附录
• 致谢