BB-102介导的基因修饰瘤苗治疗多发性骨髓瘤的实验研究

论文题目: BB-102介导的基因修饰瘤苗治疗多发性骨髓瘤的实验研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 病理与病理生理学

作者: 任素萍

导师: 吴祖泽,王立生

关键词: 多发性骨髓瘤,重组腺病毒,免疫治疗,基因治疗,基因,基因,基因,小鼠

文献来源: 中国人民解放军军事医学科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是发生在B细胞系统的恶性肿瘤,标准的化疗方案仅能使40-60%病人获得暂时缓解,中位生存期不超过3年。大剂量化疗联合造血干细胞移植使缓解率明显提高,除了极少数病例,最终难免复发。患者体内存在的微小残留病(MRD)是MM复发的根源,也是进一步提高生存率和治愈率的主要障碍。正因为如此,人们对免疫治疗寄予厚望。希望在放化疗基础上结合适当的免疫治疗有可能更彻底地控制和清除MRD,进而达到痊愈。我们以往构建了携带人B7-1、GM-CSF和p53三个基因的复制缺陷型重组腺病毒BB-102。在本研究中,我们旨在利用BB-102基因修饰瘤苗提供一个MM的个体化免疫治疗方案:以BB-102为载体,在体外将三个治疗基因导入肿瘤细胞制备瘤苗,经照射后自体接种,以期提高肿瘤细胞的免疫原性,激活体内免疫系统的抗肿瘤免疫反应,进而杀死残余的肿瘤细胞。以往的研究发现:MM细胞的抗原性很弱,表面缺乏共刺激分子B7-1,而且APC成熟障碍,从而导致细胞免疫受抑制。我们的思路是以重组腺病毒BB-102感染MM细胞,介导3个目的基因瞬时表达。通过B7-1分子与CD8~+T细胞表面的CD28分子结合传递第二信号,协同第一信号诱导静止的CD8~+T细胞成为杀伤性T细胞。GM-CSF能够促进APC成熟,提高它呈递抗原的能力。p53和射线诱导肿瘤细胞凋亡,有文献表明凋亡小体比细胞碎片有更强的抗原性,从而进一步提高APC的抗原呈递水平。活化的APC通过经典抗原呈递途径激活辅助T细胞,或者通过交叉抗原呈递途径激活杀伤T细胞,从而发挥抗肿瘤效应。体外实验中我们评测了BB-102对MM细胞增殖和凋亡的影响以及免疫原性增强作用。实验采用了3种MM细胞系Sko-007、U266和RPMI8226以及病人来源的原代MM细胞。首先以GFP为报告基因,检测了腺病毒载体对MM细胞系以及原代MM细胞的感染效率。在此基础上评价了BB-102及相关重组腺病毒(其中BB-102的基因组中以串联方式携带3个目的基因:B7-1、GM-CSF和p53;Ad-p53/B7-1、Ad-p53/GM-CSF、Ad-p53和Ad-GFP作为对照)在MM细胞的表达和生物学效应:采用FACS、ELISA和Western blot分别检测了BB-102介导的B7-1、GM-CSF和p53在MM细胞的表达;用MTT法以及Annexin Ⅴ标记分别检测了BB-102对MM细胞系的增殖抑制作用和诱导凋亡作用;混合淋巴细胞和

论文目录:

缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分：BB-102与相关重组腺病毒的扩增及其对MM细胞的感染效率

1 材料

1.1 细胞系

1.2 MM标本

1.3 重组腺病毒

1.4 主要试剂

1.5 主要仪器

1.6 主要液体及配制

2 方法

2.1 重组腺病毒扩增纯化以及病毒滴度测定

2.2 FACS检测CD138分子在MM细胞系的表达

2.3 CD138免疫磁性分离原代MM细胞

2.4 RT-PCR检测CAR在MM细胞的表达

2.5 腺病毒载体对MM细胞系的感染效率

2.6 腺病毒载体对原代MM细胞的感染效率

3 结果

3.1 五种重组腺病毒及其感染滴度

3.2 MM细胞系表达CD138分子

3.3 CD138磁珠分离原代MM细胞的得率和纯化效率

3.4 MM细胞表达CAR

3.5 重组腺病毒对MM细胞系有较高感染效率

3.6 重组腺病毒能够有效感染原代MM细胞

4 讨论

第二部分：BB-102介导的B7-1、GM-CSF和p53基因在MM细胞的表达及其生物学效应

1 材料

1.1 外周血

1.2 HLA-A2阳性对照DNA

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

1.5 主要液体及配制

2 方法

2.1 FACS检测BB-102介导的B7-1在MM细胞的表达

2.2 ELISA检测GM-CSF的分泌表达

2.3 Western blot检测p53在MM细胞的表达

2.4 MTT法检测BB-102对MM细胞系的增殖抑制作用

2.5 Annexin V检测BB-102对MM细胞系的诱导凋亡作用

2.6 密度离心法分离PBL

2.7 DNA提取和HLA-A2基因PCR扩增

2.8 混合淋巴细胞和肿瘤细胞反应(MLTR)

2.9 细胞毒分析

2.10 统计学分析

3 结果

3.1 BB-102介导B7-1分子在MM细胞表达

3.2 BB-102介导MM细胞分泌表达GM-CSF

3.3 BB-102介导MM细胞高水平表达P53蛋白

3.4 BB-102对MM细胞的增殖抑制作用

3.5 BB-102对MM细胞系的凋亡诱导作用

3.6 PCR方法筛选HLA-A2~+的人PBL

3.7 体外诱导异基因靶细胞杀伤分析

3.8 靶细胞特异性杀伤分析

3.9 HLA分子阻断实验

3.10 MLTR

3.11 细胞毒分析

4 讨论

第三部分：BB-102基因修饰瘤苗对HuPBL-NOD／SCID小鼠的免疫保护作用

1 材料

1.1 实验动物

1.2 外周血

1.3 MM细胞系

1.4 主要试剂

1.5 主要材料和仪器

2 方法

2.1 琼脂扩散法检测小鼠血清中人Ig水平

2.2 FACS检测小鼠脾脏中人淋巴细胞

2.3 FACS检测小鼠移植瘤中人CD138~+细胞

2.4 PCR扩增法筛选HLA-A2~+PBL供者

2.5 肿瘤组织切片病理分析和人T淋巴细胞免疫组化染色

2.6 NOD／SCID小鼠的人免疫系统重建(HuPBL-NOD／SCID mice)模型

2.7 MM皮下移植瘤成瘤实验

2.8 HuPBL-NOD／SCID小鼠实验分组和瘤苗接种

2.9 基因修饰瘤苗的免疫保护实验

2.10 统计学分析

3 结果

3.1 HuPBL-NOD／SCID小鼠模型的建立

3.2 MM皮下移植瘤模型的建立

3.3 筛选HLA-A2~+PBL制备HuPBL-NOD／SCID小鼠

3.4 瘤苗接种对MM移植瘤生长的抑制作用

3.5 皮下移植瘤的病理分析和免疫组化染色

3.6 模型的有效性分析

4 讨论

结论

参考文献

文献综述

致谢

博士期间发表的论文

发布时间: 2005-09-05

参考文献

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