GX-50对巨噬细胞NF-κB抗炎症通路影响的研究

论文摘要

炎症反应是机体对损伤性伤害的一种防御性反应,适度的炎症有利于激活免疫系统清除病原体,同时促进组织愈合。但若炎症反应过度,产生级联放大效应,将导致更严重的自身损伤,从而增加多种疾病的发病率和死亡率。以往的研究大多从体液因素的角度出发来寻找抗炎症药物,而胆碱能抗炎症通路的提出为抗炎症研究提供了新的方向。与体液抗炎症通路相比,胆碱能抗炎症通路具有器官保护以及对抗过度炎症和免疫反应的特性,起效快并且作用广泛。但是,目前常用的a7nAChR激动剂,如尼古丁,卡巴胆碱和烟碱等,虽然可以降低炎症,但均有一定的毒性,会对血压,呼吸,心率有一定的抑制作用,这大大限制了其临床运用。因而开发低毒性的a7nAChR激动剂对于胆碱能抗炎症机制运用于临床治疗的研究具有重要意义。研究目的:GX-50是从花椒中提取的一种有效成分,通过药物软件分析发现其是一种潜在的α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂。我们的前期实验已经发现GX-50能够和大鼠皮质神经细胞表面的α7烟碱型乙酰胆碱受体结合,有效抑制Aβ诱导的皮质神经细胞凋亡。本研究目的是探讨GX-50对LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症因子的影响以及其在NF-κB炎症通路上的作用。研究方法:选用不同浓度的GX-50处理小鼠巨噬细胞,用MTT法检测其对于细胞活性的影响并选择合适的加药浓度。然后,通过ELISA法和real time PCR法测定GX-50对于LPS诱导的IL-1β和TNF-α这两种炎症因子的影响。再通过EMSA来检测GX-50对于细胞核内NF-κB的量的影响。最后通过western blot来探索GX-50在NF-κB炎症通路上的影响。实验结果:MTT检测的结果显示1×10-8～10-4M的GX-50对巨噬细胞的活性没有显著影响,从中选择了10-6M作为之后GX-50的加药浓度。在用GX-50预处理细胞1h,然后再加入LPS处理细胞4h后,发现GX-50抑制了LPS诱导的巨噬细胞中IL-1β和TNF-α这两种炎性因子的分泌,并且其对应的基因的表达也受到了抑制。之后检测GX-50对于NF-κB炎症通路的影响,发现GX-50对于NF-κB的表达,对于IκB、IKK的磷酸化以及TLR2的表达均有抑制作用。实验结论:综上所述,GX-50能够在巨噬细胞中,抑制LPS诱导的炎性因子的分泌,并且能够抑制NF-κB炎症通路的活性。但是GX-50是否能够与巨噬细胞表面的α7烟碱型乙酰胆碱受体结合,其结合后是如何发挥抗炎症作用的,还需要更多的研究证实。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩写
• 第一章 绪论
• 1.1 巨噬细胞
• 1.1.1 巨噬细胞的功能
• 1.1.2 巨噬细胞表面的受体
• 1.2 内毒素诱导的免疫反应
• 1.2.1 LPS 诱导炎症反应
• 1.2.2 LPS 的丝裂素激活的蛋白激酶（MAPK）激活通路
• 1.2.3 LPS 的核转录因子NF-κB 信号通路激活
• 1.3 α711AChR 的抗炎症研究进展
• 1.3.1 神经系统的抗炎症研究
• 1.3.2 α711AChR 的结构
• 1.3.3 免疫细胞内的α711AChR 研究状况
• 1.3.4 α711AChR 调节免疫细胞活性方式
• 1.4 α711AChR 在抗炎症药物研究中的进展及发展
• 第二章 GX-50 对巨噬细胞NF-κB 抗炎症通路影响的研究
• 2.1 仪器和材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小鼠巨噬细胞分离和纯化
• 2.2.2 小鼠巨噬细胞鉴定
• 2.2.3 MTT 法检测细胞活性
• 2.2.4 ELISA 法检测细胞因子
• 2.2.5 Real time 法检测细胞因子基因的表达
• 2.2.6 细胞浆蛋白和核蛋白提取
• 2.2.7 细胞蛋白的定量
• 2.2.8 EMSA 法检测NF-κB 表达
• 2.2.9 Western blot 法检测 NF-κB 通路相关蛋白表达
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 巨噬细胞的鉴定
• 2.3.2 巨噬细胞活性检测
• 2.3.3 GX-50 对于LPS 诱导的炎性因子分泌的影响
• 2.3.4 GX-50 对于LPS 诱导的炎性因子基因表达的影响
• 2.3.5 GX-50 对于LPS 诱导的NF-κB 的影响
• 2.3.6 GX-50 对于 NF-κB 抗炎症通路中相关蛋白表达的影响
• 2.4 讨论
• 第三章 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附件