调节性T细胞在再生障碍性贫血发病机制中的作用

论文摘要

再生障碍性贫血（AA）是由多种病因、多种发病机理引起的骨髓造血功能衰竭、造血细胞数量减少所引发的，以贫血、出血和感染为主要症状的一组异质性疾病。再障发病机理较为复杂，以往认为再障的发生与造血干细胞损伤、造血微环境缺陷及免疫介导有关，三种机制在不同的患者个体中单独或联合作用，导致造血功能衰竭。近年来越来越多的学者认识到免疫机制紊乱尤其是细胞免疫功能紊乱在再障发病中的作用，已成为再障基础研究方面一个最活跃的领域。因此，继续深入探讨免疫学发病机理具有重要的理论意义和实用价值。近十年来，有研究表明有一组T细胞可以在体内和体外抑制T细胞反应，在一些体外建立的自身免疫性疾病的动物模型中，人们发现了这群细胞，它的存在可以预防自身免疫反应的发生。现在越来越多的研究表明机体内存在着一系列针对自身反应性T细胞的免疫调节机制，除了克隆清除、克隆无能和免疫忽视等被动机制外，胸腺产生的调节性T细胞（T-regs）所介导的免疫抑制作用是一种重要的主动机制，可通过与细胞的直接接触或分泌抑制性的细胞因子如IL-10、转化生长因子β（TGF-β），发挥抑制自身反应、维持自身免疫耐受的重要作用。一旦去除T-regs或T-regs功能障碍即可导致各种自身免疫性疾病的产生。骨髓间充质干细胞（MSC）是骨髓微环境中一种重要的具有多向分化潜能的非造血细胞，最新研究表明，MSC具有免疫调节作用、造血支持作用，对造血干细胞（HSC）具有肯定的扩增作用，MSC是HSC体外扩增的理想滋养层细胞，也是体内理想造血微环境。鉴此，我们通过体外建立再生障碍性贫血动物模型，来探讨在再障的免疫发病机制中，调节性T细胞所发挥的作用，以此来探讨再障的治疗中，可能的新的治疗途径。并利用胎源性骨髓间充质干细胞在体外培养，进行再生障碍性贫血的治疗，以研究MSC可以促进造血植入，并探讨其临床应用前景，并为再障的治疗提出新的治疗途径。目的：研究调节性T细胞在导致再生障碍性贫血发病的免疫机制作用中的作用。并体外培养胎源性间充质干细胞，以探讨治疗再障可能的新的途径。方法：取B6（C57BL／6）和BALB／cBy小鼠，培育产生cBy／B6F1。体外利用B6的淋巴细胞建立再生障碍性贫血的动物模型，用流式细胞术检测在动物模型中调节性T细胞的表达。通过与正常小鼠的比较，来探讨在再生障碍性贫血的发病机制中调节性T细胞可能的作用。取流产胎儿（12-16周）股骨骨髓细胞，培养间充质干细胞并传代，并注射入形成再障的小鼠体内，以观察其对造血的支持作用及调节性T细胞的变化。结果：cBy／B6F1在注射入其父本B6的淋巴结提取的细胞悬液后，大约淋巴细胞数在10-40×106／鼠，可引起全血细胞减少，经骨髓细胞涂片检查及骨髓活检检查证实为再生障碍性贫血，进行外周血流式细胞检测，发现CD4+CD25+、CD8+CD28-的调节性T细胞的显著减少，以及CD103、CD152、GITR阳性细胞表达的减少和CD62L的增多。取流产胎儿的骨髓细胞培养的细胞呈纺锤形外观，传代至F2代时细胞形态为均一的长梭形。表型检测示该类细胞高表达CD29、CD44、CD49E，低表达CD106、CD54、CD11b，而不表达造血细胞标志CD34。将培养传代的骨髓间充质干细胞，回输AA小鼠后，发现可以使小鼠的外周血造血部分恢复，造血功能改善后，CD4+CD25+、CD8+CD28-调节性T细胞的升高。结论：再生障碍性贫血模型中出现了CD4+CD25+和CD8+CD28-的降低，CD8+CD28+的升高，CD8+CD25+、CD4+CD28+、CD4+CD152+、CD8+CD152+、CD4+CD103+、CD8+CD103+、CD4+GITR均出现了不同程度的降低，而CD4+CD62L+、CD8+CD62L+出现了升高，这可能与调节性T细胞的减低，对自身免疫反应的抑制作用削弱有关。再障患者中T淋巴细胞处于活化状态，并于发病前T细胞向骨髓组织选择性定向归巢活化增殖，继而引发骨髓干／祖细胞损伤和造血衰竭。CD62表达的异常升高，介导了活化的T淋巴细胞向骨髓组织的归巢，而调节性T细胞的比例下调，使对于活化的T淋巴细胞对于自身的免疫应答反应的抑制作用减弱，从而产生了针对自身骨髓的损伤反应。而胎源性间充质干细胞的输入，可以引起造血的恢复，从而证实了MSC可以促进造血植入，MSC与HSC联合输入可提高HSC移植的成功率，降低移植物抗宿主病的发生率，加速造血的重建。调节性T细胞在MSC输注后出现了明显的升高，从而证实了MSC可以对机体T细胞亚群的组成产生影响，促进调节性T细胞的升高，从而诱导机体的免疫耐受。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 研究背景
• 第一部分 再生障碍性贫血动物模型的制备
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 调节性T细胞在再生障碍性贫血模型发病中的作用
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 胎源性间充质干细胞对调节性T细胞的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 研究生期间发表或待发表的文章
• 缩略词表
• 致谢
• 详细摘要