原发性脑干损伤后大鼠延髓网状结构NOS和CR的表达变化

论文摘要

原发性脑干损伤（Primary brain stem injury,PBSI）是一类特殊的脑挫伤,通常指暴力作用于头部引起脑干为主的损伤,并于伤后立即发生持续时间较长的意识丧失乃至死亡。脑干损伤的类型包括脑干横断、挫裂、挫伤出血、弥散性轴索损伤（diffuse axonal injury,DAI）和水肿等,脑干损伤时形态学改变与其机能障碍的不一致性尤为明显,后三种损伤在肉眼观时其形态学改变可以不明显,但它们同样可以引起死亡。目前仍缺乏颅脑损伤早期致死的诊断指标系统未能解决脑伤后迅速死亡者的法医学鉴定。颅脑损伤致死必须经过脑干功能衰竭的阶段。能否找到脑干功能衰竭的相关指标就成为解决死因诊断的关键问题。有研究表明,中枢神经系统内一氧化氮（NO）参与脑缺血损伤和神经退行性变的病理生理过程,一氧化氮合酶（NOS）催化NO合成,且是其合成的唯一限速酶。NOS有三种亚型:内皮型NOS（eNOS）,主要存在于血管内皮细胞;神经元型NOS（nNOS）,主要分布于神经细胞;诱导型NOS（iNOS）,主要存在于巨噬细胞;其中eNOS和nNOS又合称结构型NOS（cNOS）。应用非特异性的NOS受体阻断剂左硝基精氨酸甲酯阻断颈动脉结扎大鼠,结果既可能缩小脑缺血灶的梗死区也可能加重脑缺血的损伤,提示NOS的三种亚型对组织具有不同的效应。钙超载是脑缺血再灌注后导致神经元的选择性和延迟性损害的主要机制之一,钙结合蛋白（Calretinin,CR）能激活Ca2+/Mg2+-ATP酶活性阻止Ca2+过度蓄积,在神经元内起钙缓冲作用。综合现有文献,本研究在邓平建立的脑干损伤动物模型的基础上,采用常规病理组化、比色法（530nm激发光）及免疫组化等技术,以SD大鼠延髓网状结构内的神经元作为研究对象,并对脑干损伤的致死性病变进行定位,以探索原发性脑干损伤后的死亡机制。按照课题设计,本研究分为三个部分。实验方法及实验结果如下:1.脑干损伤动物模型的建立:自制动物模型装置,主要由铁支架、引导管、打击物及木板组成。实验动物为45只雄性SD大鼠,重量为350-400g,采用100g/L水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠,使大鼠俯卧于底座上;调整引导管对准枕骨粗隆,并观察呼吸和心率等生命体征的改变。让打击物从导引管的65cm处自由下滑打击大鼠,作用力的大小表示为65em/4508/45°,每次大白鼠只打击一次,其中5只大鼠即刻死亡未计入组内。生前损伤组25只,其中1h内死亡者10只,记为脑干损伤死亡组;20只存活于分别于伤后6h、12h、24h和48h分别处死,记为伤后存活组,每组5只;正常对照组10只不进行打击即处死。结果:伤后1h内死亡者,脑干内见散在的点状出血和椭圆形小片状出血,伤后存活组者,脑干内出现点状出血灶。镜下发现损伤多见于第四脑室下角和脚间窝对应的背侧和腹侧的浅表脑组织内,此处是呼吸中枢和心血管中枢神经元集中的区域。2.比色法检测延髓网状结构内总NOS、iNOS、cNOS活性:实验对象从上述各组中随机选取,每组5只。严格按照NOS测定试剂盒（分型）的操作步骤进行。结果发现:与对照组比较,1h死亡组和伤后存活组（6h、12h、24h）延髓的NOS和cNOS均升高,iNOS无显著性变化;伤后存活组（48h）iNOS升高,NOS和cNOS与对照组比较无显著性差异。（cNOS=NOS-iNOS）3.免疫组化检测延髓网状结构中神经元nNOS和CR的改变。正常对照组延髓仅见少量nNOS阳性神经细胞,1h死亡组和伤后存活组（6h、12h、24h）可见大量阳性细胞呈片状分布,伤后存活组（48h）的脑干内仅见少量的阳性细胞.正常对照组延髓见大量CR阳性神经细胞,1h死亡组和伤后存活组的CR阳性细胞减少,且随时间呈进行性减少趋势。根据以上三部分的研究结果。我们得出下列结论:1、采用上述模型制作的脑干损伤模型打击损伤部位主要位于第四脑室下角与脚尖窝之间的连线及附近组织中,这些部位包含了与呼吸中枢和心血管中枢有关的神经结构,能够较好的模拟人体真实状态下的颅脑损伤情况,且操作简便,易于评价,故可用于脑干损伤的发生机制、病理生理改变及损伤后果等方面的研究。2、在伤后一段时间（48h）内,NOS参与了原发性脑干损伤的过程。cNOS（以nNOS表达为主）主要参与了原发性脑干损伤,而iNOS主要参与了迟发性脑干损伤。3、CR的神经元的受损造成Ca2+升高,并激活cNOS合成大量NO,表明钙平衡失调和NO大量生成可能是原发性脑干损伤迅速死亡的机制之一。4、从cNOS和nNOS变化曲线分析,原发性脑干损伤短时间死亡是多因素共同作用的结果,cNOS的升高是其中的一个重要因素。此外我们还观察到,在伤后24h cNOS表达达到顶峰时,大鼠却仍能存活,因此在伤后存活阶段一定存在对抗nNOS高表达的保护性因素,其作用机制和表达规律将是下一步的研究工作。5、nNOS和CR的变化曲线表明CR是神经元内对抗Ca2+过度升高的一个保护因素,是否存在其它保护因素、作用机制如何将是下一步探索的方向。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1、脑干损伤动物模型的建立及效果评价
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 2、比色法检测延髓网状结构NOS、iNOS、cNOS活性
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 3、免疫组化检测延髓网状结构中神经元nNOS和CR的改变
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 英文缩略语对照表
• 附图与说明
• 在读期间发表文章
• 致谢