应用RNAi技术抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的、严重危害养猪业的主要传染性疾病之一,给世界范围的养猪业造成巨大经济损失。PRRS病毒（PRRSV）对宿主淋巴细胞有严格嗜性,其RNA基因组易变异,常规的疫苗设计策略难以产生理想的免疫效果,因此,探索防治该病的新方法有重要意义。RNA干扰（RNA interference,RNAi）作为新的有效抗病毒工具,其机制与建立在病毒蛋白基础上的传统的疫苗免疫机制不同,是转录后mRNA水平上的基因沉默机制,通过双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）分子阻断或者降低同源基因的表达而达到抗病毒复制的效果。在哺乳动物细胞中,21～23nt的小干扰dsRNA（small interfering RNA,siRNA）可以诱导同源基因特异表达抑制,为探索抗病毒研究提供了新思路。 本研究首先针对PRRSV中含量最高、相对保守的核衣壳蛋白（N）编码序列ORF7基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个特异siRNA序列（siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294）,同时设计一个无相关序列（siRNA-C）对照,利用一步PCR法产生包含鼠U6启动子的发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达盒（shRNA95-PCR、shRNA179-PCR、shRNA218-PCR、shRNA294-PCR和shRNA-C-PCR）,带shRNA表达盒的PCR产物分别与表达N蛋白的重组质粒pEGFP-ORF7共转染293T细胞,荧光显微镜下检测表达绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）细胞比例,快速筛选有效siRNA片段。筛选N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系,验证了筛选片段的基因沉默效果,在PRRSV感染的MARC-145细胞中证明筛选的siRNA片段可以明显减轻PRRSV引起的特异性细胞病变。 为了使shRNA获得长久表达并适合于大量制备,将PCR法制备shRNA表达盒插入到pEGFP-N1质粒载体,构建shRNA表达载体（pEN95-shRNA、pEN179-shRNA、pEN218-shRNA、pEN294-shRNA、pEC-shRNA）,转染MARC-145细胞,在mRNA水平及蛋白质水平检测shRNA表达载体对PRRSV复制的抑制。结果证明pEN179-shRNA可以明显减轻PRRSV引起的特异性细胞病变;在间接免疫荧光分析（indirect immunofluorescent assay,IFA）和Western blot检测中,pEN179-shRNA处理细胞的PRRSV N蛋白阳性细胞及N蛋白表达量比对照的明显减少;荧光定量PCR（fluerenscence quantatitive PCR,FQ-PCR）和病毒滴定检测发现pEN179-shRNA处理细胞中N蛋白的mRNA比对照减少了96%,病毒滴度比对照减少了681倍。此外,pEN179-shRNA抑制效应在一定范围内呈明显的剂量依赖性。在检测pEN179-shRNA抑制PRRSV ORF7 mRNA的同时,对次要结构蛋白的mRNA表达水平的变化进行检测,结果表明,次要结构蛋白GP2、GP3、GP4的mRNA表达水平分别比对照减少了60%、30%、55%,证明PRRSV的复制受到了抑制,而且pEN179-shRNA的抑制作用是特异的。 为了了解次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用,针对各基因分别选取4个siRNA位点,构建相应的shRNA表达载体（21、22、23、24、31、32、33、34、41、42、43、44）。FQ-PCR筛选可以减少PRRSV感染MARC-145细胞中ORF2、ORF3、ORF4相应mRNA含量的特异shRNA表达载体,病毒效价滴定表明这些shRNA表达载体（23、24、31、34、41）处理细胞培养上清中的病毒滴度比对照低4.65～184倍,但IFA检测中没有发现明显差异,推测次要结构蛋白在病毒感染中有重要作用。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 PRRSV研究进展
• 1.1.1 PRRS和PRRSV
• 1.1.2 PRRSV感染的细胞生物学
• 1.1.3 PRRSV的复制、转录和翻译
• 1.1.4 PRRSV的复制酶蛋白
• 1.1.5 PRRSV的主要结构蛋白
• 1.1.6 PRRSV的次要结构蛋白
• 1.1.7 PRRSV的免疫抑制和持续性感染
• 1.1.8 细胞凋亡与PRRSV致病的关系
• 1.1.9 准种、异常RNA与PRRSV致病的关系
• 1.1.10 PRRSV的防制策略
• 1.2 RNAi研究进展
• 1.2.1 RNAi概述
• 1.2.2 RNAi的分子机制
• 1.2.3 哺乳动物细胞中特殊的RNAi现象
• 1.2.4 RNAi的应用
• 1.2.5 RNAi的局限性及应用前景
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 基于PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSVN蛋白特异的有效siRNA序列
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 质粒、细胞和病毒
• 2.1.2 试剂、抗体
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 siRNA的筛选和shRNA表达盒的设计
• 2.1.5 shRNA表达盒的扩增和纯化
• 2.1.6 表达N-EGFP融合蛋白载体的构建
• 50的测定'>2.1.7 病毒CCID₅₀的测定
• 2.1.8 用shRNA-PCR转染293T细胞
• 2.1.9 N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系的筛选
• 2.1.10 PCR-shRNA转染MARC-145及PRRSV的感染
• 2.1.11 间接免疫荧光法检测shRNA-PCR对PRRSV的抑制
• 2.2 结果
• 2.2.1 一步PCR法扩增shRNA表达盒
• 2.2.2 Karber法计算病毒滴度
• 2.2.3 pEGFP-ORF7重组质粒的鉴定
• 2.2.4 shRNA-PCR抑制N-EGFP融合蛋白的表达
• 2.2.5 shRNA179-PCR在N-EGFP稳定表达细胞系上的效果
• 2.2.6 shRNA179-PCR抑制了PRRSV特异性细胞病变的产生
• 2.2.7 shRNA179-PCR减少PRRSV感染细胞中的N蛋白阳性细胞
• 2.3 讨论
• 第三章 基于载体表达的shRNA在MARC-145细胞上对PRRSV复制抑制的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 质粒、细胞和病毒
• 3.1.2 试剂、抗体
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 引物探针设计
• 3.1.5 shRNA表达载体的构建
• 3.1.6 shRNA表达载体的纯化
• 3.1.7 shRNA表达载体的转染
• 3.1.8 IFA检测shRNA表达载体对PRRSV复制的抑制
• 3.1.9 Western-blot检测N蛋白表达变化及抑制作用的剂量依赖性
• 3.1.10 荧光定量PCR检测抑制效果
• 3.1.11 毒价滴定检测抑制效果
• 3.2 结果
• 3.2.1 shRNA表达盒的扩增和shRNA表达载体的构建
• 3.2.2 shRNA表达载体抑制PRRSV引起的特异性细胞病变
• 3.2.3 shRNA表达载体减少PRRSV阳性细胞
• 3.2.4 shRNA表达载体在蛋白水平减少N蛋白表达
• 3.2.5 shRNA表达载体在RNA水平减少N蛋白表达
• 3.2.6 shRNA表达载体对病毒毒价的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 PRRSV ORF2～4特异siRNA的筛选及其抑制效果的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 质粒、细胞和病毒
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.1.4 ORF2、ORF3、ORF4的扩增及克隆载体的构建
• 4.1.5 Taqman探针及引物的设计
• 4.1.6 siRNA筛选及shRNA表达盒设计
• 4.1.7 shRNA表达载体的构建
• 4.1.8 shRNA表达载体的转染及病毒的感染
• 4.1.9 荧光定量PCR检测抑制效果
• 4.1.10 病毒毒价滴定检测抑制效果
• 4.2 结果
• 4.2.1 shRNA的扩增及表达载体的构建
• 4.2.2 ORF2、ORF3、ORF4的扩增及重组质粒的鉴定
• 4.2.3 shRNA表达载体抑制PRRSV特异性细胞病变
• 4.2.4 荧光定量PCR检测ORF2、ORF3和ORF4 mRNA的表达变化
• 4.2.5 病毒毒价滴定结果
• 4.3 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历