针对MTA1 mRNA的siRNA载体构建及其对基因沉默作用

论文摘要

背景和目的恶性肿瘤是临床上深感棘手的难题，其致死的主要原因是肿瘤细胞发生浸润、转移。肿瘤的转移是一个涉及多种基因及其产物的复杂过程，包括肿瘤细胞从原发灶脱离，侵入血管、淋巴管，黏附内皮细胞而停留在远隔部位，向外浸润，诱导新生血管形成，逃避宿主抗肿瘤反应和在转移部位生长等过程。因此了解肿瘤浸润、转移所涉及的基因和基因产物是目前国内外一项重要的研究课题。近年来已有很多关于肿瘤转移相关基因的表达与肿瘤转移关系的研究，以期寻找出安全有效的治疗恶性肿瘤的方案，延长恶性肿瘤患者的生存期，改善其生活质量。肿瘤转移相关基因（metastasis associated gene 1，MTA1）定位于染色体14q32.3，人MTA1基因编码分子量为82KD，含715个氨基酸残基的蛋白质MTA1。MTA1蛋白具有明显的亲水性，不属于细胞表面蛋白或分泌蛋白。蛋白羧基末端富含脯氨酸，与SH3结合域完全配对。而SH3在信号转导通路中参与蛋白和蛋白间相互作用，构成细胞骨架组分，并与信号转导通路中与浸润和转移相关的基因有关。MTA1蛋白还具有9个蛋白激C（PKCs）、2个酪氨酸激酶（TKs）、7个酪蛋白激酶Ⅱ（CKⅡ）的磷酸化位点以及4个N2糖基化位点。说明MTA1蛋白可能在信号转导通路中与其他一些维持细胞正常功能的蛋白发生作用。运用Southern blotting分析发现，MTA1基因在进化当中高度保守。MTA1被认为是细胞核小体重构和脱乙酰基复合物（nucleosome remodeling and histone eacetylase，NuRD）的组成部分之一，NuRD具有核小体重构与组蛋白脱乙酰酶活性。组蛋白乙酰化能选择性的使某些染色质区域的结构由紧密变得松散，开放某些基因的转录，增强其表达水平，ATP依赖的NuRD的乙酰化与脱乙酰化代表了胞核结构与功能调整的一般机制。它们通过影响染色质的状态来调整转录复制过程，调控组蛋白脱乙酰基从而发挥其生物学作用。目前多数研究认为MTA1的高表达与一些上皮源性肿瘤的侵袭转移密切相关。MTA1可能是通过参与信号传导与基因表达调控一系列有关浸润转移的蛋白而起重要作用。MTA1基因的作用将为恶性肿瘤侵袭转移的调控提供一个有效的作用靶点和控制手段。近几年来兴起的RNA干扰技术，为肿瘤的分子生物治疗开辟了新的途径。与传统基因沉默技术相比，具有效果强、持续时间长等优势，目前这一技术已在肿瘤的基因治疗方面显示出诱人的前景。本实验拟构建针对MTA1 mRNA的siRNA重组载体，将siRNA对应的DNA发卡样双链序列克隆入载体内，位于H1启动子下游，转染入肿瘤细胞内，在细胞内表达MTA1靶向的siRNA分子，特异性沉默MTA1的表达。方法依据GenBank中MTA1基因（NM004689）的序列，利用以下几个网址提供的设计分析软件进行设计http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNAdesign.html；http://www2.takara-bio.co.jp/sirna-d/top.php。对上述候选序列通过美国生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）的在线同源序列检索http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast，确定针对MTA1的siRNA序列。合成MTA1发卡样siRNA寡核苷酸，退火成双链DNA，克隆入T载体，利用α互补和T7／SP6 PCR扩增筛选鉴定重组子pGEM-T-MTA1；用BgⅢ和HindⅢ双酶切重组子pGEM-T-MTA1和siRNA表达载体pSuperneo；将双粘MTA1发卡样siRNA片段亚克隆入siRNA表达载体pSuperneo中；利用BgⅢ和HindⅢ双酶切筛选鉴定重组子pSuperneo-MTA1；对插入序列进行DNA序列分析。将siRNA表达载体pSupemeo-MTA1转入人骨肉瘤细胞系MG-63中，用RT-PCR方法检测细胞MTA1 mRNA表达水平。结果1．得到116个候选MTA1 siRNA靶区段，对上述候选序列通过美国生物技术信息中心的在线同源序列检索，最后确定的编码序列是19个碱基，GACCCTGCTGGCAGATAAA（即481-499nt）。2．siRNA发卡DNA的退火后，电泳可见明亮条带，位子约70bp处，与设计完全一致。3．退火产物与pGEM-T Easy连接后，转化JM109，筛选鉴定后得到重组子pGEM-T-MTA1。4．亚克隆后，用BgⅢ和HindⅢ双酶切对重组质粒进行鉴定，得到pSuperneo-MTA1。5．对重组子pSuperneo-MTA1插入片段DNA序列测序，结果与设计完全一致。6．转染pSuperneo-MTA1的实验组骨肉瘤细胞中MTA1 mRNA表达几乎完全被抑制，而两个对照组（无关siRNA对照组和空载体对照组）和未转染的骨肉瘤细胞系MG-63细胞中都存在较高水平的MTA1 mRNA表达。结论1．设计出针对MTA1的发卡样siRNA寡核苷酸片段。2．成功构建出针对MTA1的siRNA表达载体pSuperneo-MTA1。3．pSuperneo-MTA1转染骨肉瘤细胞后能显著降低细胞MTA1 mRNA表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文
• 针对MTA1 mRNA的siRNA载体构建及其沉默作用
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 肿瘤转移相关基因MTA1的研究进展
• 参考文献
• 英文缩略词
• 致谢