人毛囊源间充质干细胞体外立体与平面培养方法比较的实验研究

论文摘要

干细胞是体内一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。干细胞是再生医学的原基，可用于组织修复、器官再生、基因治疗等研究和临床治疗。目前研究比较深入的有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、毛囊间充质干细胞等。毛囊间充质干细胞，不仅自我更新，定向分化为脂肪、骨、软骨细胞，更重要的是毛囊间充质干细胞表达胚胎干细胞标志物（SOX2和Nanog）。毛囊来源丰富、获取方便、收获不受年龄的限制，几乎不会对机体造成任何损害，还可重复获取，并且免疫原性地下，是组织修复、器官重建和基因治疗重要的种子细胞来源。再生医学研究与治疗需要大量种子细胞，传统的平面培养方法很难在短时间获取大量种子细胞，而应用微载体、生物反应器技术立体培养就可以解决这一问题。微载体表面积/体积（S/V）大，单位体积培养液细胞产率高；立体培养兼悬浮和贴壁培养的优点，简化细胞生长环境因素的检测和控制，重现性好，成本低，劳动强度小。通过立体培养可以获得大量的毛囊间充质干细胞，然而其生长特性、生物学特性未知。本实验研究目的是建立体外大量扩增人毛囊间充质干细胞（human hair folliclemesenchymal stem cells，hHF-MSCs）的生物反应器技术，从而为再生医学研究与临床治疗提供未分化、大量的种子细胞。拔取成人毛发，采用组织块培养法，成功获得了hHF-MSCs。我们将获取的hHF-MSCs成功的接种至载体上，经吖啶橙染色，共聚焦显微镜扫描，可以观察到hHF-MSCs贴附于载体表面并伸展呈长梭形。hHF-MSCs以1000cells/cm2或500cells/cm2密度接种至载体上，细胞在接种第3d时进入对数生长期，增殖至15d时细胞进入平台期；平面培养hHF-MSCs至第6天时进入对数生长期。间充质干细胞表面标志CD90、CD105免疫荧光染色，二种方法培养hHF-MSCs呈阳性表达；流式细胞术分析：立体培养hHF-MSCs CD90、CD105表达率分别为80.25%、45.36%，平面培养hHF-MSCsCD90、CD105表达率分别为85.65%、43.88%；这二种方法培养hHF-MSCs经成脂诱导后，油红O染色，脂滴呈红色；成骨诱导后，茜素红染色，可见钙盐沉积和钙结节被染成红色。本研究成功获取hHF-MSCs，建立体外大量扩增hHF-MSCs生物反应器技术，应用该技术培养的hHF-MSCs仍能保持MSCs表面标志，并具有多向分化潜能，这为后期建立hHF-MSCs银行，构建组织工程化器官，移植修复病变的组织器官，作为基因治疗的靶细胞等相关实验研究及临床应用提供了丰富的种子细胞来源。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 毛囊源性间充质干细胞
• 1.1.1 毛囊的结构
• 1.1.2 毛囊的生长周期
• 1.1.3 毛囊间充质干细胞的形成和特点
• 1.2 微载体技术
• 1.2.1 微载体的发现
• 1.2.2 微载体应用于组织工程再生
• 1.2.3 微载体在骨、软骨再生中的应用
• 1.2.4 微载体在皮肤再生中的应用
• 1.2.5 微载体在干细胞中的应用
• 第2章 实验内容
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器及设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基及常用液体
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 hHF-MSCs 的分离培养
• 2.2.1.1 原代培养
• 2.2.1.2 传代培养
• 2.2.2 hHF-MSCs 立体与平面培养
• 2.2.2.1 立体培养
• 2.2.2.2 平面培养
• 2.2.3 hHF-MSCs 接种至微载体吖啶橙染色
• 2.2.4 hHF-MSCs 生长曲线绘制
• 2.2.5 hHF-MSCs 免疫荧光染色
• 2.2.6 hHF-MSCs 流式细胞术分析
• 2.2.7 hHF-MSCs 体外成脂诱导
• 2.2.8 hHF-MSCs 体外成骨诱导
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 形态学观察
• 2.3.2 hHF-MSCs 立体培养
• 2.3.3 生长曲线绘制
• 2.3.4 免疫荧光染色
• 2.3.5 流式细胞术检测
• 2.3.6 成脂、成骨的诱导
• 第3章 讨论
• 第4章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢