环境内分泌干扰物对神经母细胞瘤生长的影响

论文摘要

研究背景与目的：近年来，随着人类生产活动的飞速发展，环境内分泌干扰物（EED）的污染已成为全球关注的重要议题。EED主要来源于杀虫剂、塑料、洗涤剂、燃烧产物及工农业产物，这些物质进入机体后，干扰内分泌系统功能，从而对机体产生一系列的不良反应。最近，EED对性激素敏感性恶性肿瘤的影响成为研究热点，但有关EED和儿章肿瘤相关性的报道还很少。神经母细胞瘤是儿章好发的恶性胚源性肿瘤，其病因不明，孕前或孕期中父母及儿章早期的环境暴露因素日益受到关注。实体瘤的生长很大程度上依赖于血管生成，而神经母细胞瘤具有较强的致血管形成性和血管依赖性，此点已经引起人们的极大兴趣。EED是否对神经母细胞瘤的生长和肿瘤血管生成产生影响，目前国内外尚未见相关报道。本研究拟以EED为干预物质，观察其对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞、人脐静脉血管内皮细胞体外增殖和SK-N-SH细胞移植瘤体内生长的影响；并检测细胞周期进展、细胞凋亡和肿瘤血管的生成，以探讨EED促神经母细胞瘤生长可能的作用途径。本实验将揭示EED对神经母细胞瘤潜在的致癌作用，从而为儿童肿瘤的预防、治疗和强化环境保护措施的制定提供可靠的科学理论依据。 材料与方法： （一）人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞体外增殖实验：SK-N-SH细胞经常规培养扩增后分为7组：组1，无干预（对照组）；组2，加17β-雌二醇（E2）；组3，加双酚A（BPA）；组4，加玉米赤酶烯酮（ZEA）；组5，同时加E2和ICI 182，780；组6，同时加BPA和ICI 182，780；组7，同时加ZEA和ICI 182，780。分别在0、24、48和72 h检测细胞光吸收度值（AV），72 h用流式细胞仪检测DNA增殖指数（PI）及细胞凋亡指数（AI）。并在72 h采用脱氧核糖核苷酸木端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）观察细胞凋亡情况，用免疫组化及Western Blot分析法检测细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4、p21及PCNA的蛋白表达。 （二）人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）体外增殖实验：HUVEC经常规培养扩增后分为11组：组1，无干预（对照组）；组2，加17β-雌二醇（E2）；组3，加双酚A（BPA）；组4，加玉米赤酶烯酮（ZEA）；组5，加壬基酚（NP）；组6，加邻苯二甲酸-2-乙基己酯（DEHP）；组7，同时加E2和ICI 182，780；组8，同时加BPA和ICI 182，780；组9，同时加ZEA和ICI 182，780；组10，同时加NP和ICI 182，780；组11，同时加DEHP和ICI 182，780。分别在0、24、48和72 h检测光吸收度值（AV），72 h流式细胞仪检测DNA增殖指数（PI）及细胞凋亡指数（AI）。72 h用TUNEL观察细胞凋亡情况，同时采用免疫组化及Western Blot分析法检测CyclinD1、CDK4、p21及PCNA的表达。 （三）移植瘤体内生长实验：BALB／C雌性裸小鼠40只，1×107／0.2ml的SK-N-SH细胞接种于皮下，可触摸到肿瘤结节时，随机分为四组：组1，假手术组（SHAM）；组2，卵巢切除（OVX）为对照组；组3，OVX+E2（E2）；组4，OVX+BPA（BPA）。每周测两次肿瘤体积，第18天处死裸鼠，测量瘤重，运用免疫组化、Western Blot法检测CyclinD1、CDK4、p21、PCNA和血管内皮细胞生长因子、Ⅷ因子相关抗原等的表达，并计算微血管密度，用流式细胞仪检测肿瘤细胞的DNA增殖指数（PI）。 结果： （一）SK-N-SH细胞体外增殖实验：SK-N-SH经各种物质干预后，各时点的AV均有增加。72 h时，组3、4的AV值分别为1.02±0.11、1.05±0.04，是对照组（0.86±0.25）的1.19～1.22倍（p＜0.05）；组3、4的P1分别为25.57±1.89％、25.70±0.60％，较对照组（17.96±1.31％）分别提高42.4％和43.1％（p＜0.01），组2的AV和PI与组3、4结果相似（p＞0.05）；72 h时，组5、6、7的AV和PI明显低于组2、3、4（p＜0.01）。72 h时，对照组及组5、6、7中均出现明显的亚二倍体峰，组2、3、4峰值较小，E2、BPA、ZEA组的AI值分别为6.31±1.42％、7.41±2.34％、8.08±1.23％，明显低于对照组（35.75±15.90％，p＜0.05）。用TUNEL方法检测结果与之相似；免疫组化和Western Blot检测发现组2、3、4中CyclinD1、CDK4及PCNA的表达明显高于对照组和5、6、7组（p＜0.05），p21在各组之间没有统计学性差异（p＞0.05）。 （二）HUVEC体外增殖实验：E2、BPA、ZEA、DEHP组中的AV在24、48、72 h均明显增加。72 h时，对照组、BPA、ZEA、NP、DEHP组的AV分别为0.56±0.12、0.76±0.04、0.74±0.07、0.90±0.15、1.00±0.04。4种物质组的AV约是对照组的1.3～1.7倍（p＜0.05）。72 h，以上5组的PI分别为30.86±7.08％、44.81±4.29％、44.21±2.60％、44.13±3.06％、44.67±3.41％。BPA、ZEA、DEHP组的尸哟是对照组1.5倍（p＜0.05），加入ICI 182，780后，细胞增殖受到明显抑制。72 h时，对照组及加入ICI 182，780组中出现明显的亚二倍体峰，E2、BPA、ZEA、NP、DEHP组峰值较小，AI分别为8.25±3.32％、10.59±4.92％、9.81±4.60％、10.65±3.63％、9.83±5.29％，较对照组（45.16±11.50％）明显降低（p＜0.05）。用TUNEL法检测结果与之相似；免疫组化和Western Blot检测发现组2、3、4中CyclinD1、CDK4及PCNA的表达明显高于对照组和5、6、7组（p＜0.05），p21在各组之间没有统计学性差异（p＞0.05）。 （三）移植瘤体内生长实验：BPA、E2、SHAM组的移植瘤生长较对照组快，BPA组肿瘤体积较对照组提高59％（p＜0.05），肿瘤重量较对照组增高82％（p＜0.05），瘤体内细胞PI提高19％（p＜0.05），微血管密度提高83％（p＜0.01），VEGF蛋白表达增高54％（p＜0.05）。此外，CyclinD1、增殖细胞核抗原的表达均较对照组明显增高（p＜0.05），但CDK4、p21在各组中免疫染色为弱阳性或无着色，Western Blot分析显示两者在各组间没有显著性差异（p＞0.05）。E2、SHAM组的结果与BPA组相似。 结论： 1．环境内分泌干扰物双酚A、玉米赤酶烯酮可促进神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的体外增殖。雌激素受体通路、细胞凋亡抑制和细胞周期进展可能参与了该促增殖作用。 2．双酚A、玉米赤酶烯酮可促进人脐静脉血管内皮细胞的体外增殖。雌激素受体通路、细胞凋亡抑制和细胞周期进展可能参与了该促增殖作用。 3．壬基酚、邻苯二甲酸-2-乙基己酯促进人脐静脉血管内皮细胞的体外增殖，及其具体作用途径不确定，有待进一步研究。 4．双酚A可促进人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系裸鼠移植瘤的生长。 5．细胞周期进展、肿瘤血管生成可能参与了双酚A、雌二醇促人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系裸鼠移植瘤体内生长的作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写索引
• 前言
• 第一部分 双酚A和玉米赤酶烯酮对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞体外增殖的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 四种环境内分泌干扰物对人脐静脉血管内皮细胞体外增殖的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 双酚A对神经母细胞瘤体内生长的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 研究生期间完成论文
• 致谢
• 综述
• 附页