共轭链上取代五甲川菁染料的合成、光谱性能及应用

论文摘要

多甲川菁类荧光染料是一类非常重要的荧光染料,具有大的摩尔消光系数,吸收、发射波长可以随着共轭链长度的改变在可见光到近红外范围（400—1000 nm）可调,在核酸测序、蛋白质标记、中性小分子和离子的识别、细胞、组织以及活体成像等方面得到了广泛的应用。五甲川菁染料（Cy5）吸收波长和发射波长在650—700 nm,接近近红外区,是波长最短的近红外菁染料。本论文工作主要是在以N-位乙基取代吲哚类五甲川菁染料为荧光母体,在共轭链的中位（α-位）和偏位（β-位）引入活性位点,合成甲川链上不同取代基的Cy5染料,考察了这类染料的光谱性能及生物应用。首先,总结前人关于菁染料光稳定性的研究结果,合成了九个中位连接不同取代基的五甲川菁染料Ⅱa-Ⅱh和Ⅲa（包括诱导吸电子基团（Br和Cl）,共轭吸电子基团（醛基）Ⅱf、Ⅱh和共轭供电子基团（乙烯基）Ⅱg）；研究结果表明中位引入共轭吸电子基团（醛基）时,染料的光稳定性能得到显著的提高,而且有两组吸收和发射峰,产生假的大斯托克斯位移,进而合成中位二氰基乙烯基取代Cy5 （Ⅲa）。相比其他菁染料,这类染料是一种交叉共轭结构荧光团,具有双吸收和双荧光发射峰,可设计成比例变化荧光探针。中位共轭基团在非黏性或低黏度溶液中能够自由转动消耗掉激发能,淬灭荧光,染料荧光量子产率大幅度降低,在生物检测中具有低的背景荧光。根据理论计算结果可知,电子从第二激发态直接回到基态发射短波长荧光与从第一激发态回到基态发射长波长荧光的受到溶液黏度不同程度的影响；随着溶液黏度的增加,染料在两个发射峰处的荧光强度都增加,并且在长波长处的荧光增加更多,荧光呈现比例变化。除了从势能面上考虑染料的双发射波长外,从结构上可将染料看作两部分组成,根据交叉共轭结构染料的特征,可将染料看成是是短波长的荧光团和长波长的荧光团组成,实现在短波长处激发,发射出长波长的荧光。此外,染料在长波长处的荧光寿命随着黏度的增加也明显延长,比例荧光和荧光寿命不受生物基质（蛋白质和DNA）干扰,可以同时采用比例荧光成像和荧光寿命成像来研究细胞内的黏度,是一种双模式的粘度荧光探针,提高检测结果的准确性和可靠性。其次,设计了合成偏位不同氨基取代的五甲川菁染料新路线。所合成荧光染料（Ⅳa-Ⅳg）有两个吸收峰和一个发射峰,与传统五甲川菁染料相比,新合成菁染料吸收发射显著蓝移,斯托克斯位移明显增加（63 nm以上）。理论计算表明,在基态甲川链强缺电子,偏位氨基的电荷转向甲川链,电子云密度降低,与甲川链具有很强的耦合作用,C-N键变短,氨基几何构型趋向平面型,甲川链共轭被氨基阻断,吸收波长变短；光激发后染料首先受到垂直激发,电荷从两端苯环向中间甲川链转移到氨基上,氨基作为电荷受体的激发态分子内电荷转移（acceptor-ICT （a-ICT））,氨基上电子云密度增加,与甲川链耦合作用减弱,氨基上电子云密度增加,构型发生变化,甲川链重新共轭,形成能量较低的激发态,发射出长波长的荧光,增加斯托克斯位移。当偏位连接伯胺时,氨基发生假姜-泰勒（pseudo-Jahn Teller, PJT）变化,即平面型向四面体转变；当偏位仲胺取代时,既有平面型向四面体的转变（PJT）,也伴随着扭曲激发态电荷转移的变化（TICT）;当氨基是叔胺时,主要发生扭曲分子内电荷转移变化（TICT）。在激发态氨基构型的变化是产生大斯托克斯位移的关键,通过黏度实验对推测的产生大斯托克斯位移的机理进行了验证,在高黏度的溶液中,快速的构型变化受到抑制,发射出短波长的荧光,证明了理论推测的正确性。偏位氨基取代五甲川菁染料的荧光量子产率受溶剂极性的影响很大,从水到二氯甲烷中,染料的荧光量子产率变化增加100倍以上,在大极性环境中背景荧光低,且黏度对染料的影响不及极性影响显著。可以用于检测疏水性环境（如功能性蛋白质的疏水空腔或细胞内疏水环境）,偏位不同氨基取代染料（Ⅳa、Ⅳb和Ⅳc）与表面含不同疏水空腔蛋白质作用后荧光增加倍数也不同,含两个羟基染料Ⅳc对蛋白质的检测具有好的线性关系和大的荧光增强,后染BSA的检测限可达到20 ng；细胞内疏水性环境的成像结果表明,染料能作为极性探针对细胞内疏水性环境进行荧光成像。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 多甲川菁染料的研究进展
• 1.1 引言
• 1.2 菁染料介绍
• 1.2.1 菁染料的结构特征
• 1.2.2 多甲川菁染料结构和光谱的关系
• 1.2.3 菁染料的合成方法
• 1.2.4 菁染料的光稳定性与改善方法
• 1.2.5 菁染料的自聚集
• 1.2.6 菁染料的斯托克斯位移（Stokes Shift）
• 1.3 菁染料的生物应用
• 1.3.1 核酸分子（DNA）识别
• 1.3.2 蛋白标记
• 1.3.3 离子、中性小分子、pH探针以及荧光成像
• 1.4 黏度探针的应用
• 1.4.1 荧光强度黏度探针
• 1.4.2 比例荧光黏度探针
• 1.4.3 荧光寿命黏度探针
• 1.5 提高菁染料水溶性的结构修饰
• 1.6 论文的选题依据与染料分子的设计
• 第二章 中位（α位）取代Cy5的合成、光谱性能
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 中间体和染料的合成路线
• 2.2.3 中间体的合成
• 2.2.4 染料的合成
• 2.2.5 染料的吸收与发射光谱的测定
• 2.2.6 染料光稳定性测试
• 2.2.7 染料电化学测试
• 2.2.8 染料的理论计算
• 2.2.9 单晶培养与测试
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 染料的合成
• 2.3.2 染料Ⅱc和Ⅱe的单晶讨论
• 2.3.3 染料的光谱性能
• 2.4 分子转动的证明
• 2.5 降温过程增加荧光强度
• 2.6 染料光稳定性测试
• 2.7 细胞试验
• 2.8 本章小结
• 第三章 中位共轭取代双发射波长Cy5作为黏度探针的应用
• 3.1 前言
• 3.2 染料分子的结构设计及合成
• 3.2.1 实验仪器与药品
• 3.2.2 染料分子的结构与合成过程
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 染料的光谱性能与溶剂效应测试
• 3.4 染料的黏度测试实验
• 3.4.1 染料Ⅱf、Ⅲa、Ⅲb、Ⅲd和Ⅲe的黏度实验
• 3.4.2 染料Ⅱf、Ⅲa在不同黏度溶液中荧光量子产率的比较
• 3.4.3 染料Ⅱf、Ⅲa的比例黏度关系
• 3.5 理论解释比例荧光以及染料的双波长
• 3.6 生物大分子的干扰实验
• 3.6.1 蛋白质/氨基酸对染料Ⅱf的干扰测试
• 3.6.2 蛋白质、DNA对染料Ⅲa的干扰测试
• 3.7 染料的荧光寿命测试
• 3.7.1 染料Ⅱf的荧光寿命测试
• 3.7.2 染料Ⅲa的荧光寿命测试
• 3.8 染料Ⅱf和Ⅲa的细胞成像实验
• 3.8.1 染料Ⅱf的细胞成像
• 3.8.2 染料Ⅲa荧光成像
• 3.9 本章小结
• 第四章 偏位（β位）氨基取代大斯托克斯位移Cy5的合成、光谱性能
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 中间体及目标染料的合成路线
• 4.2.3 中间体的合成过程、表征
• 4.2.4 目标染料的合成及表征
• 4.2.5 染料的吸收与荧光光谱测定
• 4.2.6 染料的光稳定性测试
• 4.2.7 染料的理论计算
• 4.2.8 染料的黏度实验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 合成思路与路线设计
• 4.3.2 染料的光谱性能
• 4.4 染料大斯托克斯位移的探讨
• 4.4.1 激发态分子内电荷转移（ICT）的机理及过程
• 4.4.2 染料的溶剂效应
• 4.4.3 染料的理论计算
• 4.4.4 黏度实验
• 4.5 染料的光稳定性
• 4.6 本章小结
• 第五章 偏位氨基取代Cy5作为极性探针用于蛋白检测与活细胞成像
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 试剂与仪器
• 5.2.2 溶液的配制与滴定
• 5.2.3 蛋白后染实验
• 5.2.4 细胞成像实验
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 染料荧光性能与溶剂极性的变化
• 5.3.2 染料与大豆卵磷脂的作用
• 5.3.3 染料与ct-DNA的作用
• 5.3.4 Ⅳa、Ⅳb和Ⅳc分别与BSA的滴定
• 5.4 染料后染蛋白
• 5.4.1 蛋白质的电泳行为
• 5.4.2 染料Ⅳa、Ⅳb和Ⅳc后染蛋白
• 5.5 染料的细胞染色
• 5.6 本章小结
• 结论
• 创新点摘要
• 参考文献
• 附录A 部分化合物的核磁表征
• 作者简介
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢