α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达

论文题目: α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达

论文类型: 硕士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 李联正

导师: 何维明,张惟材

关键词: 乙酰乳酸脱羧酶,枯草芽孢杆菌,双乙酰,克隆表达,活性测定

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC，EC4．1．1．5）可以转化双乙酰的前体α-乙酰乳酸为乙偶姻而不影响啤酒风味。双乙酰是啤酒发酵代谢中的一种不良风味物质。由于降低双乙酰是啤酒成熟过程中最费时的步骤，所以加速该步骤对于啤酒酿造工业具有重要的意义。本研究包括枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的分离和在大肠杆菌中的表达；利用大肠杆菌稀有密码子的转移RNA提高α-乙酰乳酸脱羧酶表达水平及表达活性的尝试；α-乙酰乳酸脱羧酶在毕赤酵母中分泌表达；含有ALDC基因重组啤酒酵母的构建几个部分。 PCR扩增出枯草杆菌168α-乙酰乳酸脱羧酶基因，分别克隆到大肠杆菌质粒pUC18和pQE60中，构建了重组质粒pUC18-ALDC和pQE60-ALDC。序列测定结果表明编码α-乙酰乳酸脱羧酶的全长基因插入了载体pUC18；在T5启动子下，经IPTG诱导α-乙酰乳酸脱羧酶基因得到了表达，进行ALDC定性和定量测定，酶活力为0.11U／mL。为了促进α-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的表达，分别构建了pOK12-argU和pOK12-ileX两个重组质粒。pOK12-argU含有argU基因可以转录出精氨酸的转移RNA(tRNAArg)；pOK12-ileX含有ileX基因可以转录出异亮氨酸的转移RNA(tRNAileX)两个质粒分别和重组质粒pQE60-ALDC在大肠杆菌TOP10中共表达，通过活性测定和SDS-PAGE分析，结果表明表达水平得到提高。将ALDC基因克隆到了大肠—酵母穿梭质粒pPIC9中，得到的重组质粒电击转化导入巴斯德毕赤酵母GS115株中，α-乙酰乳酸脱羧酶基因基因整合到了毕赤酵母染色体上，得到可以稳定表达该基因的工程酵母菌株。在甲醇的诱导下，可以分泌表达出有α-乙酰乳酸脱羧酶活性的蛋白产物。SDS-PAGE分析可见到约62kDa的表达条带，活力测定为0.03U／mL。将α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆大肠—酵母穿梭质粒pYES2中，电击转化啤酒酵母实验菌株INVSc1，得到了可以降低双乙酰的工程菌株。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 α-乙酰乳酸脱羧酶研究进展

1.1 啤酒发酵

1.2 双乙酰的生成和还原

1.3 α-乙酰乳酸脱羧酶基因的特点

1.4 α-乙酰乳酸脱羧酶

1.5 α-乙酰乳酸脱羧酶克隆表达

1.6 啤酒酵母的改良

1.7 本论文的研究工作

第二章 ALDC在大肠杆菌中的表达和活性测定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果和讨论

2.4 讨论

2.5 小结

第三章双质粒共表达α-乙酰乳酸脱羧酶

3.1 材料和方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章在ALDC在毕赤酵母中的分泌表达

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

第五章含有目的基因啤酒酵母工程菌的构建

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 小结

总结

参考文献

致谢

英文缩写表

作者简介

发布时间: 2007-04-05

参考文献

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α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达

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