家养野猪源猪圆环病毒2型安徽株的分离鉴定及其特性研究

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）引起的临床症状主要为猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎-肾病综合征（PDNS）、猪增生性坏死性肺炎（PNP）、猪先天性脑震颤（CT）、猪的流产与繁殖障碍等。PCV2及其相关的猪病已在全世界范围内发生和流行，造成的危害相当严重。目前国内许多地方都在进行野猪资源的开发利用。为了了解安徽地区家养野猪是否存在PCV2感染，以及其在分子遗传特性和生物学特性是否存在差异。本研究对家养野猪病料进行PCV2分离与鉴定，全基因组测序以及各阅读框序列分析，与小鼠致病性实验。从而为了解家养野猪源PCV2安徽分离株的分子遗传特性和生物学特性，为猪圆环病毒病的研究提供依据。1.应用PK15细胞进行PCV2的分离与增殖，根据PCR、IFA、电镜技术进行PCV2分离株的鉴定。获得一株来自安徽家养野猪源PCV2分离株，命名为YZ0901。首次证明了安徽省家养野猪中也存在PCV2的感染。2.对YZ0901株与5株PCV2安徽分离株进行全基因组克隆和序列分析。YZ0901株基因全长1767bp组成，属于PCV2-1C基因簇，存在同源重组，与42株国内外参考毒株全基因组序列之间同源性为94.2-99.5%，ORF1和ORF2核苷酸序列同源性为96.7-100%和89.6-89.3%。YZ0901株ORF1相对保守，但ORF2差异较大，主要散在于ORF2两个主要免疫反应区内。YZ0901株基因型与安徽地区PCV2流行毒株相关。3.根据ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针，以重组质粒为标准品做标准曲线，建立了PCV2的TaqMan荧光定量PCR检测方法。TaqMan荧光定量建立的标准曲线循环阈值（Ct值）重复性较好，灵敏度约为6×101拷贝/μL，对猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟兔化弱毒无交叉反应。在临床样本检测中，该方法检测快速，灵敏度高。表明本方法快速、敏感、特异性强，具有较高的重复性，为PCV2的临床检测及组织亲嗜性、细胞培养特性等研究提供技术支持。4. YZ0901株与3株家猪源毒株进行小鼠攻毒实验，对其抗体、细胞因子和各组织中病毒粒子数量进行检测，并观察病理变化。YZ0901株的IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-10的浓度处于较低的水平，抗体波动大，引起脾小体增多和肾小球肿大、细胞增多的程度较大，且病毒粒子数的最高值（5.35×104拷贝/μL、5.995×104拷贝/μL）比其它各组大。表明YZ0901株感染小鼠，先产生细胞免疫抑制，后产生体液免疫抑制，并对脾脏、肾脏的亲嗜性较强。同属于PCV2b-1C基因簇的YZ0901株与XC0801株的免疫应答能力比PCV2b-1A（DY0801株）、PCV2b-1B（BH0801株）的低，对组织的亲嗜性则强于PCV2b-1A基因簇而弱于PCV2b-1B基因簇。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 主要缩略语列表
• 目录
• 插图和附表清单
• 文献综述
• 1 PCV2基本结构与特性
• 1.1 PCV2的发现与分类地位
• 1.2 PCV2的形态特征及理化特性
• 1.3 PCV2培养特性
• 2 PCV2分子遗传特征
• 2.1 PCV2基因组结构
• 2.2 PCV2遗传与变异
• 2.3 ORF1 基因与编码蛋白
• 2.4 ORF2 基因与编码蛋白
• 2.5 ORF3 基因与编码蛋白
• 3 PCV2感染和致病机制
• 3.1 PCV2的组织亲嗜性及靶细胞
• 3.2 PCV2的致病机理
• 3.2.1 PCV2对淋巴组织和淋巴细胞的影响
• 3.2.2 PCV2在细胞因子对免疫调节中的影响
• 4 流行病学特点
• 4.1 PCV2感染的流行病学调查
• 4.2 PCV2流行毒株序列分析
• 4.3 传染源及传播途径
• 4.4 宿主及易感动物
• 5 PCV2感染的相关临床症状及病理变化
• 6 PCVAD 检测与防治
• 6.1 PCV2检测技术
• 6.2 PCVAD 的防治
• 7 结语
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 家养野猪病例分析
• 2.1.2 病料
• 2.1.3 细胞
• 2.1.4 PCV2标准毒株、PCV2安徽分离株
• 2.1.5 PCV2阳性血清、阴性血清
• 2.1.6 试验动物
• 2.1.7 载体、菌种及分子生物学试剂
• 2.1.8 溶液和培养基的配制
• 2.1.8.1 细胞培养相关溶液配制
• 2.1.8.2 DNA 提取相关溶液配制
• 2.1.8.3 PCR 相关溶液配制
• 2.1.8.4 间接免疫荧光试验相关溶液配制
• 2.1.9 主要仪器
• 2.1.10 引物和探针序列
• 2.2 方法
• 2.2.1 病料检测
• 2.2.1.1 病料的处理
• 2.2.1.2 病料总 DNA 的提取
• 2.2.1.3 病料中 PCV2特异性基因片段的扩增
• 2.2.2 病料中 PCV2的分离鉴定
• 2.2.2.1 PCV2的分离
• 2.2.2.2 PCR 检测
• 2.2.2.3 间接免疫荧光试验
• 2.2.2.4 电镜观察
• 2.2.3 PCV2全基因组序列克隆与测定
• 2.2.3.1 PCV2全基因组序列 PCR 扩增
• 2.2.3.2 PCV2全基因组序列 PCR 扩增产物纯化与回收
• 2.2.3.3 外源 DNA 片段与质粒载体的连接反应
• 2.2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 2.2.3.5 重组质粒转化
• 2.2.3.6 质粒 DNA 小量制备
• 2.2.3.7 重组质粒的 PCR 鉴定
• 2.2.3.8 PCV2全基因组序列测定
• 2.2.4 YZ0901 株分子遗传特征分析
• 2.2.4.1 YZ0901 株全基因组序列分析
• 2.2.4.2 PCV2安徽分离株同源重组分析
• 2.2.4.3 YZ0901 株与国内外参考毒株的 ORF1、ORF2 序列分析
• 2.2.5 TaqMan 荧光定量 PCR 检测 PCV2方法的建立及应用
• 2.2.5.1 标准品的制备
• 2.2.5.2 TaqMan 荧光定量 PCR 方法反应体系和反应条件优化
• 2.2.5.3 TaqMan 荧光定量 PCR 方法标准品的建立
• 2.2.5.4 TaqMan 荧光定量 PCR 方法敏感性试验
• 2.2.5.5 TaqMan 荧光定量 PCR 方法特异性试验
• 2.2.5.6 TaqMan 荧光定量 PCR 方法重复性试验
• 2.2.5.7 TaqMan 荧光定量 PCR 方法的临床应用
• 2.2.6 YZ0901 株对小鼠致病力试验
• 2.2.6.1 半数细胞感染量（TCID50）测定
• 2.2.6.2 昆明小鼠分组及攻毒方法
• 2.2.6.3 血清中 PCV2的抗体检测
• 2.2.6.4 血清中细胞因子检测
• 2.2.6.5 TaqMan 荧光定量 PCR 对 PCV2组织亲嗜性检测
• 2.2.6.6 组织病理切片制作与观察
• 3 结果与分析
• 3.1 病料检测
• 3.2 病料中 PCV2的分离鉴定
• 3.2.1 PCR 检测
• 3.2.2 间接免疫荧光试验结果
• 3.2.3 电镜观察结果
• 3.3 PCV2全基因组序列克隆
• 3.3.1 全基因组序列 PCR 扩增结果
• 3.3.2 重组质粒的鉴定
• 3.4 PCV2全基因组序列测定：
• 3.5 YZ0901 株分子遗传特征分析
• 3.5.1 YZ0901 株全基因组序列同源性分析
• 3.5.2 YZ0901 株全基因组序列进化树分析
• 3.5.3 同源重组分析
• 3.5.4 YZ0901 株的 ORF1 核苷酸序列同源性分析
• 3.5.5 YZ0901 株的 ORF2 核苷酸序列同源性分析
• 3.5.6 YZ0901 株的 ORF2 氨基酸序列同源性分析
• 3.6 TaqMan 荧光定量 PCR 检测 PCV2方法的建立及应用
• 3.6.1 标准品的制备
• 3.6.1.1 PCR 扩增与克隆结果
• 3.6.1.2 PCR 产物的测序结果
• 3.6.1.3 TaqMan 荧光定量 PCR 方法反应体系和反应条件优化
• 3.6.1.4 TaqMan 荧光定量 PCR 方法标准品的建立
• 3.6.1.5 TaqMan 荧光定量 PCR 方法敏感性试验
• 3.6.1.6 TaqMan 荧光定量 PCR 特异性试验
• 3.6.1.7 TaqMan 荧光定量 PCR 重复性试验
• 3.6.1.8 TaqMan 荧光定量 PCR 方法的初步应用
• 3.7 YZ0901 株对小鼠致病力试验
• 3.7.1 TCID50 测定
• 3.7.2 血清中 PCV2的抗体检测
• 3.7.3 血清中细胞因子检测
• 3.7.4 TaqMan 荧光定量 PCR 对 PCV2组织亲嗜性检测
• 3.7.5 组织病理切片的制作与观察
• 4. 讨论
• 4.1 TaqMan 荧光定量 PCR 检测 PCV2方法的建立及应用
• 4.2 家养野猪源安徽分离株的分离与鉴定
• 4.3 YZ0901 株全基因组序列分析
• 4.4 同源重组分析
• 4.5 YZ0901 株的 ORF1、ORF2 核苷酸序列分析
• 4.6 YZ0901 株的 ORF2 氨基酸序列分析
• 4.7 YZ09101 株对小鼠致病力试验
• 4.7.1 YZ0901 株与家猪源 PCV2毒株感染小鼠的抗体及细胞因子水平分析
• 4.7.2 YZ0901 株与家猪源 PCV2毒株感染小鼠的组织亲嗜性分析
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介