论文摘要
高效毛细管电泳（HPCE）是近年来发展最快的分离分析技术之一,由于该技术具有简单、高效、快速、微量、经济、清洁、易于自动化和环境污染少等优点,目前已在生命科学、生物医学和环境检测等领域中得到了广泛应用。而检测器对整个毛细管电泳的检测灵敏度和检出限都有重要的影响,所以检测器的研制一直是CE技术的关键问题。目前已采用的检测器主要有:紫外-可见光吸收、激光诱导荧光、化学发光、质谱、核磁共振和电化学检测器等。其中由于激光的高亮度、高单色性和高准直性,能最大限度地激发被分离物质产生荧光,并且激光的波长范围小,对检测的影响也很小,所以激光诱导荧光是最灵敏的检测器之一。但常规的激光诱导荧光检测器,是将激光从毛细管柱外穿透毛细管壁直接引入毛细管内,射到经毛细管电泳分离的待测物上,通过激发后产生的荧光而进行在柱检测。由于激光在毛细管内壁产生了强烈的光反射、折射和散射,降低了检测器的灵敏度。同时,在柱检测,毛细管柱内被激发出来的待测物质的荧光信号也要通过在毛细管柱上开的检测窗口而被检测器收集到,在穿透毛细管壁的过程中同样会产生光的折射、散射和反射,导致检测器灵敏度的降低。为了避免此问题,同时获得一些新的毛细管电泳检测器,并建立高灵敏度的检测方法,在本研究小组系列研究成果的基础上,作了如下二个方面的工作:1.使用目前最灵敏的检测器之一——激光诱导荧光检测器,建立了饮料、茶叶和尿液中核黄素（维生B2）的分离方法。实验所用的激光诱导荧光检测器,是用光纤直接将激光光源引入到毛细管内的检测窗口处,使激光在毛细管内的缓冲溶液中激发待测物质,避免了直接将激光从毛细管外直接射入毛细管内时产生光的散射、反射、和折射,使激发光源减弱,因而提高灵敏度、降低了背景噪声。核黄素是一种水溶性维生素,本身具有荧光,因而不需要进行标记,可以直接进行毛细管电泳分离,并进行荧光检测。优化的实验条件为:有效长度为50cm的非涂层熔融硅毛细管,内径为100μm;电泳缓冲液为10.0mmol·L- 1的四硼酸钠缓冲液（pH9.6）;分离电压18kV;检测温度为室温;检测器为自组装的柱内光纤激光诱导荧光检测器,采用最大发射波长为474nm的激光。在此条件下,给出了回归方程y = 71.44±1.72 x + 41.25±0.24,式中y-核黄素的荧光强度（单位:mV）,x-核黄素的浓度,(单位:μmol·L- 1)、相关系数r2=0.998、检出限3.0nmol·L- 1、线性范围为0.05-20.0μmol·L- 1。重复性:迁移时间RSD=1.30%,（n=5）;峰高RSD=2.98%,（n=5）。同时给出了核黄素在低浓度8.0nmol·L- 1的毛细管电泳图。为了获得精确度方法的信息,给出了用本实验方法所测得的样品数据,和用AOAC标准荧光方法所测得样品中核黄素含量的数据。为了获得核黄素在人体尿液中排泄的情况,将口服核黄素代谢的尿样收集,给出了0-13小时内所收集到的尿样的典型的毛细管电泳图,并给出了相应的浓度。2.常规的激光诱导荧光检测器,必须采用激光器作为激发光源,例如氩离子激光器和氦-镉激光器,但是这些激光器可供选择的激发波长有限,而且价格昂贵、体积庞大,使用寿命短,因而大大限制了CE激光诱导荧光检测法的应用。因此设计组装了一套新的LED柱内光纤检测窗口反射聚光装置,并进行了初步探索。实验中选择了452nm的LED作为实验用光源的波长。将毛细管上检测窗口的一半进行涂银,使其成为光滑、均匀的反光镜,由于毛细管柱是圆柱形,所制成的镜面相当于凹面镜,能将毛细管内的光集中,能提高检测器的灵敏度。利用该系统分别测定了检测窗口涂银前后核黄素,当信噪比为3时,检测窗口涂银后所检测的浓度比涂银前降低了5倍。