旅顺产白眉蝮蛇（Gloydius blomhoffi brevicaudus）蛇毒去整合素的提取与纯化

论文摘要

去整合素蛇毒因其广泛的生物活性早已引起了国内外科学工作者的注意。人们从蛇毒中提出了许多具有潜在临床应用前景的单一组分。其中,去整合素（disintegrins）为一组源自于出血性蛇毒的抗黏附多肽或蛋白质的总称,因其可强力拮抗整合素（integrin）而得名。其特征为富含半胱氨酸,并多含有Arg-Gly-Asp（RGD）或Lys-Gly-Asp （KGD）亲水性氨基酸序列,分子量仅为5kD～9kD,多为单链多肽或蛋白分子。此蛇毒蛋白家族可凭借其分子中RGD序列而成为细胞外基质（ECM）与细胞整合素间结合的强有力的竞争性拮抗剂;因RGD模体能被血小板纤维蛋白原受体αⅡβ3识别,其还具有抑制ADP诱导的血小板聚集的作用。因此,去整合素可运用于与细胞黏附相关的疾病研究领域,如血管新生、肿瘤转移、血栓症等。关于去整合素的功能研究,国内外已有的相关报道为:台湾的Rhodostomin[1]和Accutin[2]、韩国的Salmosin[3,4]和Saxatilin[5]、美国的Contortrostatin[6]等,这些取自于蛇毒的去整合素均具有抑制血管新生与肿瘤转移,抑制血小板聚集等功效[1-9]。整合素为一细胞表面受体的异源二聚体家族,是一组跨膜糖蛋白。迄今为止,已知有18种不同的α亚基和8种不同的β亚基组成至少24种的异源二聚体[10-12]。α及β亚基的N末端（胞外端）共同构成配体结合位点。因为大部分细胞整合素都识别RGD氨基酸顺序,而大多数ECM蛋白都含有RGD顺序,所以RGD序列已被公认为是ECM成分与细胞整合素结合的位点[13]。整合素胞内部分较短,但可以通过α-辅肌动蛋白（α-actinin）、踝蛋白（talin）和粘着斑蛋白（vinculin）与细胞骨架相连。整合素主要介导细胞之间及细胞与ECM之间的黏附,并介导细胞与ECM之间的双向信号传导,对细胞的黏附,增殖,分化,转移,调亡起到重要的调控作用,在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用[14]。目前本实验室已经从产于中国旅顺的白眉蝮蛇（Gloydius blomhoffibrevicaudus）毒腺中提取总RNA,利用自行设计的引物进行RT-PCR扩增,获得了219bp的白眉蝮蛇去整合素基因。测序结果显示,其与韩国的蝮蛇去整合素的saxatilin的同源性最高:DNA序列同源性为95.8%,蛋白质序列同源性为91.8%,且蛋白质中含有去整合素的特征模体RGD及12个半胱氨酸。本研究室将此去整合素基因进行克隆、转化与诱导后,得到了该蛋白的可溶性高效表达。经组氨酸亲和层析纯化,获得了分子量为9kD的均质蛋白,将其命名为rAdinbitor。通过实验证明,rAdinbitor能够有效的抑制血小板的聚集,对肿瘤细胞转移,浸润和增殖也有明显的抑制作用。为了近一步比较白眉蝮蛇蛇毒中去整合素和rAdinbitor在结构、功能方面的差同,完善本试验室对蛇毒去整合素的制备工艺,本试验尝试从旅顺产白眉蝮蛇蛇毒中进行去整合素的分离和纯化。主要做了如下工作:1)利用凝胶过滤与反相高效液相色谱对旅顺产白眉蝮蛇蛇毒去整合素进行纯化,通过血小板凝集抑制试验对各洗脱组分进行活性鉴定以确定去整合素所在组分。实验结果表明,通过串联凝胶过滤和反相高效液相色谱,得到了分离纯化的白眉蝮蛇去整合素。Tricine SDS-PAGE电泳后银染,呈现出两条清晰、分离的蛋白条带,分子量分别为12kD和17kD。2)利用凝胶过滤和离子交换层析对旅顺白眉蝮蛇去整合素进行纯化,通过血小板凝集抑制试验对各洗脱组分进行活性鉴定确定去整合素所在组分。实验结果表明,通过串联凝胶过滤和离子交换层析对旅顺白眉蝮蛇去整合素进行了部分纯化。Tricine SDS-PAGE后的银染结果显示了7条蛋白条带。并且,在预计的白眉蝮蛇去整合素可能出现的分子量范围存在2条未完全分开的蛋白条带。总之,本实验通过对层析方法和条件的摸索、优化,最终确定了以串联凝胶过滤以及反相高效液相色谱对旅顺产白眉蝮蛇蛇毒中去整合素分离的方法。并得到两条清晰,分离的蛋白条带。为以后结构测定、生物活性的研究打下了基础。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一部分 利用凝胶过滤和反相高效液相色谱（RP-HPLC）对旅顺产白眉蝮蛇蛇毒去整合素进行提取与纯化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• （五） 第二部分 利用凝胶过滤和离子交换层析对旅顺产白眉蝮蛇蛇毒去整合素进行提取与纯化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• （六） 论文结论
• （七） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述 去整合素—一种具有广泛临床应用前景的小分子蛋白质
• （二） 参考文献
• 三、致谢