茶叶中二氢黄酮醇还原酶/无色花青素还原酶性质研究

论文摘要

儿茶素类是茶多酚的主体组分,是茶叶最重要的特征代谢成分,同时也是构成茶叶品质的主要化学成分。儿茶素合成途径中可能涉及的酶类有肉桂酸羧化酶（C4H）、4-香豆酰CoA连接酶（4CL）、查耳酮合成酶（CHS）、查耳酮异构酶（CHI）、二氢黄酮3-羟化酶（F3H）、二氢黄烷醇4-还原酶（OFR）、无色花色素还原酶（LAR）、花青素还原酶（ANR）等。DFR/LAR是黄酮类化合物合成下游途径中的重要酶类,在儿茶素合成途径中具有重要的调节作用。本课题对茶叶中DFR/LAR酶反应产物进行了鉴定,建立了DFR/LAR酶活性的简单测定方法,较系统地研究了DFR/LAR的动力学性质,并探讨了不同部位茶鲜叶和茶细胞系中儿茶素C和GC与DFR/LAR活性间的相关性。主要研究结果如下:1.利用高效液相色谱（HPLC）、薄层层析（TLC）、紫外可见光扫描和香草醛-盐酸比色法分别对DFR/LAR酶促反应的产物无色花青素、儿茶素C和GC进行了鉴定。在此基础上,建立了1%香草醛-盐酸比色法检测DFR/LAR酶活性的简便方法。2.建立了以辅酶NADPH在反应体系中的消耗为基础的DRF/LAR酶活性检测方法。3.采用1%香草醛-盐酸比色法、NADPH消耗方法分别对DRF/LAR酶动力学特征进行了研究,结果表明,当底物为二氢槲皮素（DHQ）时,DRF/LARDHQ酶反应的最适温度在45～65℃表现最高、最适pH为5.0、7.5～8.0;当底物为二氢杨梅素（DHM）时,DRF/LARDHM酶反应的最适温度为45℃、最适pH为7.0。底物浓度与酶反应速率间的关系不表现为典型的米氏方程,存在底物抑制现象,经直接线性作图法得到两种底物的四个表观米氏常数为KNADPH-DHQ=0.888 mmol/L、KNADPH-DHM=0.925 mmol/L、KDHQ-NADPH=0.337 mmol/L、KDHM-NADPH=1.145 mmol/L。研究结果还显示,4mmol/LMg2+、100mmol/L SDS对DRF/LAR的活性有一定提高;EDTA在0～1 mmol/L范围内对DRF/LAR活性有极强的抑制作用,而Fe3+在0～1 mmol/L范围内对DRF/LAR活性有一定的抑制作用。4.对不同部位茶鲜叶与茶细胞系云茎63中的总儿茶素含量、儿茶素C和没食子儿茶素GC含量、DRF/LAR酶活性进行了测定,结果表明,无论茶鲜叶还是细胞系,DRF/LARDHM的酶活性均高于DRF/LARDHQ;随着茶鲜叶成熟度的增加,DRF/LAR酶活性逐步下降,儿茶素GC的含量与DRF/LARDHM酶活性呈正相关性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 儿茶素生物合成途径及其相关酶类
• 1.2 DFR酶类研究进展
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粗酶液制备
• 3.2.2 酶蛋白含量测定
• 3.2.3 DFR/LAR酶反应体系及产物儿茶素的鉴定和检测
• 3.2.5 酶反应体系辅酶NADPH消耗的检测
• 3.2.6 DFR/LAR酶反应活性的定义
• 3.2.7 最适温度
• 3.2.8 最适pH值
• 3.2.9 最适酶蛋白浓度
• 3.2.10 最适底物及辅酶浓度
• 3.2.11 激活剂及抑制剂
• 3.2.12 茶鲜叶及茶细胞系中儿茶素及其DFR/LAR酶活性
• 3.3 统计方法
• 4 结果与分析
• 4.1 DFR/LAR酶反应体系中产物和底物的检测
• DHQ酶促产物儿茶素的检测'>4.1.1 DFR/LAR_DHQ酶促产物儿茶素的检测
• DHQ酶促产物儿茶素的检测'>4.1.2 DFR/LAR_DHQ酶促产物儿茶素的检测
• 4.1.3 产物原花青素的检测
• 4.1.4 底物NADPH的检测
• 4.2 酶动力学性质的研究
• 4.2.1 最适温度
• 4.2.2 最适PH值
• 4.2.3 体系中最适酶液添加量
• 4.2.4 最适底物浓度
• 4.2.5 二氢槲皮素的最适浓度
• 4.2.6 二氢杨梅素的最适浓度
• 4.2.7 体系中NADPH的最适浓度
• 4.2.8 动力学常数的测定
• 4.2.9 激活剂和抑制剂对酶活的影响
• 4.3 茶鲜叶及细胞系的儿茶素含量及其酶活性比较
• 5 讨论
• 5.1 DFR/LAR酶促反应产物的鉴定
• 5.2 DFR/LAR酶活测定——香草醛比色法的建立
• 5.3 DFR/LAR酶活测定——NADPH消耗法的建立
• 5.4 DFR/LAR酶学性质的研究
• 5.5 茶鲜叶不同部位及细胞系儿茶素含量及酶活比较
• 6 结论
• 参考文献
• 附录及缩略词
• 致谢
• 作者简介