荧光假单孢菌脂肪酶基因的克隆、改造及其在毕赤酵母中的表达

论文摘要

脂肪酶(triacylglycerol lipase EC3.1.1.3)是一种广泛存在的水解酶,能够催化甘油三酯酯键的断裂。除此之外,脂肪酶还具有多种酶活性。因其催化功能的多样性及作为一种生物催化剂的优越性,脂肪酶在许多领域中具有广泛的应用。 在动物体内,胰腺分泌脂肪酶用于消化食物中的脂肪。将脂肪酶作为饲料添加剂应用于动物养殖中具有广阔的应用前景,首先脂肪酶可以消除植物性饲料原料中的脂质抗营养因子,同时可以弥补幼禽幼畜消化道内脂肪酶的不足。但是已实现产业化生产的脂肪酶产品中,pH稳定性多在中性偏碱范围内,对酸的耐受性较差,适合于饲料用的品种很少,目前国内外也尚未见有对适合于饲料用的耐酸性脂肪酶的表达研究。本论文以毕赤酵母表达适合于饲料用脂肪酶为研究目标,对荧光假单孢菌脂肪酶基因进行了克隆、改造并分别将原始基因和改造基因在毕赤酵母中进行了表达,主要工作包括以下内容: 1.对Genbank已发表的荧光假单孢菌脂肪酶基因序列进行比对,根据两个同源性高的区域序列设计简并引物,以基因组DNA为模板PCR扩增到基因内部的一段序列,然后应用反向PCR获得了完整的基因序列,已在Genbank注册,登录号:DQ305493。 2.根据毕赤酵母密码子的偏爱性,同时综合真核基因表达中影响表达调控的因素,在不改变氨基酸序列的基础上对荧光假单孢菌脂肪酶基因进行了密码子改造。通过DNA聚合酶反应,获得了改造的荧光假单孢菌脂肪酶基因。 3.将荧光假单孢菌脂肪酶原始基因和改造基因在毕赤酵母GS115中进行了分泌表达,摇瓶水平诱导液酶活力分别为41.5U/mL和91U/mL,经密码子改造后表达量提高了2倍以上。 4.重组脂肪酶具有优良的酶学性质:最适pH为8.5,在pH 4～10范围内,脂肪酶的相对活力都在60%以上;pH 2.2～12处理30 min后仍然保留了较高的酶活力,均在70%以上,说明该酶具有较强的酸碱耐受性;最适作用温度为50℃,在35℃～60℃酶相对活力在60%以上;该酶具有较强的耐热性,60℃保温30 min剩余酶活力依然达到70%;金属离子对脂肪酶酶活力影响不大;重组脂肪酶能够抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解。综合以上情况,重组荧光假单孢菌脂肪酶能够耐受胃液pH范围内的酸性和胃蛋白酶的作用,在消化道特别是消化的主要部位小肠的pH范围内具有较

论文目录

• 第一章 绪论
• 1 脂肪酶的研究进展
• 1.1 脂肪酶的来源及产脂肪酶微生物的选育
• 1.2 脂肪酶的结构及催化机理
• 1.3 脂肪酶的性质
• 1.4 脂肪酶的生产
• 1.5 脂肪酶的应用
• 2 假单孢菌脂肪酶研究进展
• 2.1 假单孢菌脂肪酶生化性质
• 2.2 假单孢菌脂肪酶基因克隆
• 2.3 假单孢菌脂肪酶基因表达调控
• 2.4 假单孢菌脂肪酶分泌机制
• 3 毕赤酵母表达系统研究进展
• 3.1 毕赤酵母表达宿主菌
• 3.2 毕赤酵母表达载体
• 3.3 外源基因的整合
• 3.4 外源基因在毕赤酵母中的表达
• 3.5 毕赤酵母表达系统的优化
• 3.6 毕赤酵母表达系统的局限性
• 4 本研究的意义与目的
• 4.1 本研究的意义
• 4.2 本研究的目的
• 第二章 荧光假单孢菌脂肪酶基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种和载体
• 1.2 工具酶和生化试剂
• 1.3 试剂盒
• 1.4 培养基及溶液配制
• 1.5 常用仪器
• 1.6 荧光假单孢菌基因组DNA的提取
• 1.7 引物设计
• 1.8 PCR扩增目的基因片段
• 1.9 反向PCR扩增目的基因片段的上下游序列
• 1.10 目的基因片段的回收
• 1.11 PCR扩增基因片段与pGEM—T载体的连接
• 1.12 E.coli DH5α感受态细胞制备及转化方法
• 1.13 SDS碱裂解法小量制备质粒DNA
• 1.14 重组单克隆的PCR验证
• 2 结果与分析
• 3 讨论与小结
• 第三章 荧光假单孢菌脂肪酶基因的改造
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种和载体
• 1.2 工具酶和生化试剂
• 1.3 试剂盒
• 1.4 培养基及溶液配制
• 1.5 常用仪器
• 1.6 基因合成示意图
• 1.7 引物设计
• 1.8 基因合成过程
• 1.9 链延伸反应
• 1.10 PCR
• 1.11 片段拼接反应
• 1.12 目的基因片段序列测定
• 2 结果与分析
• 2.1 脂肪酶改造基因PflipM的设计
• 2.2 脂肪酶改造基因PflipM的合成
• 3 讨论与小结
• 第四章 荧光假单孢菌脂肪酶原始基因和改造基因在毕赤酵母中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种和载体
• 1.2 工具酶和生化试剂
• 1.3 试剂盒
• 1.4 培养基及溶液配制
• 1.5 仪器
• 1.6 重组表达载体pPIC9K—PflipO的构建
• 1.7 重组表达载体pPIC9K—PflipM的构建
• 1.8 质粒DNA的大量提取
• 1.9 重组表达载体的线性化
• 1.10 毕赤酵母感受态的制备
• 1.11 转化毕赤酵母
• 1.12 重组毕赤酵母的筛选
• 1.13 重组毕赤酵母的PCR验证
• 1.14 目的基因在毕赤酵母中的表达
• 1.15 重组脂肪酶的活力检测
• 1.16 重组脂肪酶的酶学性质研究
• 2 结果与分析
• 2.1 重组表达载体的构建
• 2.2 重组毕赤酵母的筛选和鉴定
• 2.3 重组毕赤酵母的诱导表达
• 2.4 重组脂肪酶的酶学性质研究
• 3 讨论与小结
• 3.1 关于脂肪酶在毕赤酵母中的表达
• 3.2 关于脂肪酶的活力测定
• 3.3 关于脂肪酶的酶学性质
• 第五章 结论与工作设想
• 1 主要研究结论
• 2 本研究的创新点
• 3 下一步的工作设想
• 参考文献
• 致谢
• 附录