论文摘要
目的:从人外周血中获得imDC,并与另一个体脐血来源的初始性CD4+T细胞混合培养,运用特异性阻断剂zVAD-fmk阻断Caspase信号传导通路,研究Caspase通路在imDC诱导同种异体T细胞转化为Treg细胞中的作用,探讨免疫耐受可能的分子机制。方法:取健康成年人外周静脉血50ml,用密度梯度离心法分离PBMC,将分离的单个核细胞培养2h后加入GM-CSF和IL-4诱导、扩增7天,使其转化为imDC。另取其他健康胎儿脐血10ml,密度梯度离心法分离出单个核细胞,用免疫磁珠分选法从单个核细胞中分离CD4+T细胞,均分为5组细胞:（1）空白组:初始性CD4+T细胞加入等容量RPMI-1640单独培养;（2）混合对照组:imDC与初始性CD4+T细胞以1:10的浓度比例混合培养,不加其他试剂,诱导Treg;（3）低浓度zVAD-fmk组:imDC与初始性CD4+T细胞以1:10的浓度比例混合培养同时加入终浓度为10μmol/L的zVAD-fmk;（4）中浓度zVAD-fmk组:imDC与初始性CD4+T细胞以1:10的浓度比例混合培养同时加入终浓度为20μmol/L的zVAD-fmk;（5）高浓度zVAD-fmk组:imDC与初始性CD4+T细胞以1:10的浓度比例混合培养同时加入终浓度为30μmol/L的zVAD-fmk。再进行混合培养5天,以流式细胞仪检测CD4+CD25+T细胞（Treg细胞）转化率。结果:（1）、imDC的鉴定:形态学方面:培养至第七天的PBMC悬浮生长,表面可见毛刺状突起,体积较前增大,镜下观察:成簇的细胞团散开,形态不规则的贴壁细胞减少。经诱导后,流式细胞仪检测细胞表面分子。（2）、混合培养后以FCM检测T细胞转化率,T细胞转化为CD4+CD25+T细胞的转化率??为:空白组:1.78±0.11、混合对照组:22.23±0.77、低浓度zVAD-fmk组:21.63±0.82、中浓度zVAD-fmk组:12.24±0.54、高浓度zVAD-fmk组:12.20±0.96、,除混合对照组和低浓度组、中浓度组和高浓度组之间外,各组间P值<0.05,差异有显著性。结果说明:加入zVAD-fmk并与imDC细胞混合培养的T细胞转化率相对于未加入阻断剂的T细胞较低,同时Caspase信号通路对zVAD-fmk无浓度依赖性。结论:（1）、通过应用rhGM-CSF+rhIL-4联合诱导PBMC获得imDC,建立了一种imDC的体外培养方法。（2）、imDC可以诱导同种异体初始性CD4+T细胞分化为Treg。（3）、Caspase信号通路特异性的阻断剂zVAD-fmk可以部分抑制Treg的转化,说明Caspase信号通路在免疫耐受的诱导中可能起了较为重要的作用。