猴头菌锰过氧化物酶基因克隆及在构巢曲霉中的表达

论文摘要

本研究对猴头菌Hericium erinaceum（Bull.:Fr.）Pers.菌株CB1进行了系统发育分析和分类鉴定,对其主要木质素降解酶系统进行了的检测,用其酶液对4种不同类型的染料茜素红、中性红、刚果红、结晶紫进行了脱色处理；以菌株CB1为基因供体,克隆得到锰过氧化物酶（MnP）同工酶基因Hemnpl和Hemnp2的全长cDNA基因及基因组全长DNA基因,通过荧光定量PCR检测了Hemnp1和Hemnp2基因的差异表达,并构建了重组质粒,通过原生质体转化方法将2个MnP同工酶基因转化到了构巢曲霉中,最终获得2个有效表达的MnP同工酶基因的构巢曲霉工程菌株。主要研究结果如下：1.首先对猴头菌菌株CB1进行了培养特性的观察,结果表明,菌株的宏观培养特性与猴头菌子实体的颜色和形态非常相似。对包括猴头菌菌株CB1在内的5种猴头菌属17个菌株进行了基于ITS序列的系统发育分析,结果表明菌株CB1与猴头菌同种其他菌株遗传距离较近并聚类在一起,该菌属于猴头菌科、猴头菌属的猴头菌。2.明确了该菌株的分类地位后,采用低氮天冬酰胺-琥珀酸（LNAS）培养基,在填加不同浓度的Mn2+和木屑为底物的情况下,对其进行了木质素降解酶系统的检测。结果表明,猴头菌可同时产生MnP和漆酶,但不产生LiP。不同锰离子为底物的检测中,以Mn2+的浓度600μmol·L-1为底物,MnP酶活性最高达259.55U-Lq,表明Mn2+对MnP的酶活性起到诱导作用,是猴头菌产生MnP的必要因子。通过酶活性的检测,了解了菌株CB1木质素降解酶系统的主要酶系及其与培养基的成分和酶作用的底物等条件的关系。当胞外酶的酶活达到最佳时,将4种不同结构的染料加入培养体系进行共同培养,从猴头菌固／液体培养基对染料的脱色结果来看,在4个染料浓度5mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L中,对茜素红和中性红的脱色效果最好,其次是刚果红,对结晶紫脱色效果表现出较难被降解。3.采用简并PCR、RT-PCR、RACE、Genome Walking-PCR等方法,克隆得到2个猴头菌MnP同工酶基因,命名为He-mnp1和He-mnp2。He-mnp1的cDNA基因含有1080bp,编码359aa;He-mnp2的cDNA基因含有1086bp,编码361aa.He-mnp1与He-mnp2两个同工酶DNA和cDNA基因之间同源性分别为67%和81%,He-mnp1和He-mnp2的基因组全长都含有11个外显子和10个内含子。使用BioEdit软件、ClustalW2.1软件、3D软件等预测并分析了猴头菌He-mnp1和He-mnp2的蛋白质序列。4.采用实时荧光定量PCR技术,检测了猴头菌2个MnP同工酶基因之间的差异表达水平。结果猴头菌He-mnp1基因在第10d Mn2+浓度为200μm/1的表达水平最高,He-mnp2基因在第7d Mn2+浓度为600μm/1下转录水平达到最高He-mnp2基因最高表达量比He-mnp1基因最高表达量高出8倍,可见He-mnp2基因受Mn2+的影响较大。猴头菌MnP同工酶基因之间存在不同的转录调控机制,随时间的变化He-mnp1和He-mnp2同工酶基因表达水平达到最高后,无论提高锰离子浓度或者增加诱导时间表达量都受到抑制,He-mnp1基因和He-mnp2基因都受锰离子浓度的不同程度的诱导调控。5.利用RT-PCR方法克隆得到猴头菌He-mnp1和He-mnp2完整MnP同工酶CDS基因转化于构巢曲霉中进行异源表达,构建了重组质粒pLB01/He-mnp1和pLB01/He-mnp2。采用PEG/CaCl2介导的原生质体转化方法,将两个重组质粒转入到了构巢曲霉缺陷体菌株TN02A7的原生质体中,获得了转化子菌株TN02A7-He-mnpl和TN02A7-He-mnp2。将2个转化子菌株、缺陷体菌株TN02A7、WJA01、猴头菌菌株CB1在相同的木质素环境下进行了MnP活性的检测,结果TN02A7-He-mnpl在有血红素存在的情况下,诱导96h后酶活最高为38.31U.L-1,比不加血红素的酶活力高出8.64倍；而TN02A7-He-mnp2在有血红素存在的情况下,诱导96h后酶活最高为64.06U-L-1,比不加血红素的酶活力高出15.88倍,结果表明血红素是重组MnP基因异源表达的限制性因素之一。但在144h时转化子菌株都比猴头菌菌株CB1的酶活低,而TN02A7与WJA01始终无MnP酶活性,证明基因He-mnpl和He-mnp2已经成功地被转化到构巢曲霉中,并在木质素环境下已得到表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 猴头菌的研究概况
• 1.2.1 猴头菌菌种鉴定
• 1.2.2 猴头菌的生物学研究概况
• 1.3 木材腐朽菌
• 1.3.1 木材腐朽
• 1.3.2 Peroxidases的分类
• 1.3.3 白腐菌降解木质素的酶系统
• 1.4 锰过氧化物酶
• 1.4.1 白腐菌锰过氧化物酶同工酶基因
• 1.4.2 白腐菌锰过氧化物酶同工酶诱导的条件
• 1.4.3 白腐菌锰过氧化物酶同工酶的分析技术
• 1.4.4 基因启动子序列
• 1.4.5 白腐菌锰过氧化物酶分离纯化
• 1.4.6 木质素降解酶的脱色处理
• 1.5 MnP基因的表达
• 1.5.1 MnP基因的同源表达
• 1.5.2 MnP基因的异源表达
• 1.6 现代分子生物学技术
• 1.6.1 分子生物学技术的应用
• 1.6.2 荧光定量PCR技术
• 1.6.3 重组DNA技术
• 1.6.4 预测蛋白三维结构及软件
• 1.7 研究目的和意义
• 1.8 研究的主要内容
• 1.9 课题来源
• 2 猴头菌CB1形态特征与系统发育分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种来源
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 培养特性的试验与观察
• 2.1.4 ITS序列扩增与系统发育分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 猴头菌菌株CB1的培养特性
• 2.2.2 猴头菌菌株CB1的ITS序列与系统发育分析
• 2.3 本章小结
• 3 猴头菌CB1锰过氧化物酶的检测与染料脱色的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 主要试剂和染料
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 产酶培养及酶活测定
• 3.1.5 四种染料在固体培养基和液体培养基的脱色
• 3.1.6 四种染料的标准曲线绘制
• 3.1.7 染料脱色率的计算方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 猴头菌木质素降解酶系统及不同锰离子浓度的MnP的检测结果
• 3.2.2 四种染料在固体培养基中的脱色
• 3.2.3 四种染料的标准曲线绘制结果
• 3.2.4 四种染料在液体培养基中的脱色效果
• 3.3 本章小结
• 4 猴头菌CB1锰过氧化物酶同工酶基因克隆及序列分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 试验引物
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.1.5 提取猴头菌的总RNA和DNA
• 4.1.6 猴头菌MnP的cDNA基因克隆
• 4.1.7 猴头菌MnP的.DNA基因克隆及启动子区序列
• 4.1.8 生物信息学分析与基因序列预测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 猴头菌不同锰离子浓度的总DNA及MnP简并PCR的扩增
• 4.2.2 猴头菌不同锰离子浓度的总RNA及MnP同工酶cDNA基因片段
• 4.2.3 猴头菌He-mnp1和He-mnp2同工酶cDNA基因的3'和5'RACE结果
• 4.2.4 猴头菌He-mnp1和He-mnp2同工酶基因全长cDNA的PCR扩增结果
• 4.2.5 猴头菌He-mnp1和He-mnp2同工酶基因全长DNA的PCR扩增结果
• 4.2.6 猴头菌He-mnp1和He-mnp2同工酶基因的5’和3’非翻译区的扩增结果
• 4.2.7 猴头菌MnP的cDNA和DNA全长序列及启动子区序列分析
• 4.2.8 猴头菌MnP同工酶基因的蛋白结构分析
• 4.3 本章小结
• 5 猴头菌MnP同工酶cDNA基因实时荧光定量PCR
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 试验引物
• 5.1.4 主要仪器设备
• 5.2 方法
• 2+浓度的诱导处理'>5.2.1 猴头菌菌丝的收集及不同Mn²⁺浓度的诱导处理
• 5.2.2 猴头菌总RNA的制备及质量检测
• 5.2.3 猴头菌He-mnp1、He-mnp2及内参基因He-β-tubulin的cDNA片段的扩增
• 5.2.4 实时荧光定量RT-PCR
• 5.2.5 猴头菌锰过氧化物酶基因荧光定量数据分析
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 猴头菌He-mnp1、He-mnp2基因及He-β-tubulin内参基因的cDNA片段的扩增
• 5.3.2 不同浓度的MnSO4溶液处理过程中He-mnp1和He-mnp2基因及表达
• 5.4 本章小结
• 6 猴头菌MnP基因在构巢曲霉的异源转化与差异表达
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 菌株、质粒与试剂
• 6.1.2 培养基及转化用溶液
• 6.1.3 重组质粒的构建及双酶切与双酶切引物PCR验证
• 6.1.4 原生质体制备与转化
• 6.1.5 转化子的PCR鉴定
• 6.1.6 转化子MnP酶活测定
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 重组质粒的鉴定
• 6.2.2 原生质体的制备
• 6.2.3 转化子的筛选
• 6.2.4 转化子的PCR鉴定
• 6.2.5 转化子MnP酶活测定
• 6.3 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录1 猴头菌菌株CB1的ITS序列比对结果
• 附录2 猴头菌He-mnp1和He-mnp2 cDNA序列同源比对
• 附录3 猴头菌He-mnp1和He-mnp2基因组DNA序列同源比对结果
• 附录4 猴头菌He-mnp1和He-mnp2的5'启动子区序列比对结果
• 附录5 猴头菌He-mnp1和He-mnp2的3'非翻译区序列比对结果
• 附录6 猴头菌荧光定量He-β-tubulin的内参基因比对结果
• TM 18-T He-mnp2双酶切验证结果'>附录7 载体质粒pMDTM 18-T/He-mnp1和pMD^TM 18-T He-mnp2双酶切验证结果
• 附录8 重组质粒pLB01/He-mnp1和pLB01/He-mnp2的PCR扩增结果
• 附录9 转化子菌株TN02A7-He-mnp1和TN02A7-He-mnp2的PCR扩增结果
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢