四川两种林木真菌病害病原的分子检测技术研究

论文摘要

由枯斑拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis funerea Desm.）引起的松赤枯病是松树幼龄林常见的病害,已成为我省主要针叶林木病害。云杉叶疫病是由一种根球壳孢菌（Rhizosphaera kalkhoffii Bubak.）引起的重要林木真菌病害,在云南香格里拉、川西地区均有发生。本研究以枯斑拟盘多毛孢菌、根球壳孢菌为研究对象,通过设计特异性引物扩增松树（Pinus.sp.）、云杉（Picea.sp）针叶基因组DNA的方法来快速、高效地检测松赤枯病病原、云杉叶疫病病原,为林木病害病原的快速分子诊断及其病害防控措施的制定提供参考。本研究以rDNA的ITS区序列在真菌分类上的应用为基础,针对枯斑拟盘多毛孢菌共合成引物7对,筛选出一对最优引物,标号为AF,其序列为：F（5’-3’）:GTCAACCAGCGGAGGGAT18bpR（5’-3’）:CGCCGTTGTATTTCAGGAG19bp针对根球壳孢菌共合成引物6对,筛选出一对最优引物,标号为EU2,其序列为：F（5’-3’）:CCAACCAAACTCTTGTATTAA21bpR（5’-3’）:GGGTATCCCTACCTGATCCGA21bp在松赤枯病病原菌的分子检测过程中,2011年3月前高山松（P.densata）、华山松（P.armandi）、马尾松（P.massoniana）和云南松（P.yunnanensis）的针叶上均没有检测到枯斑拟盘多毛孢菌的存在；2011年3月,在石象湖地区的马尾松松针和二郎山地区的云南松针尖部、中部开始检测到枯斑拟盘多毛孢菌的存在；2011年6月,在二郎山地区的云南松松针基部也检测到枯斑拟盘多毛孢菌的存在。在云杉叶疫病病原菌的分子诊断过程中,全年共采样9次,在2011年7月前,二郎山地区云杉针叶上均没有检测到根球壳孢菌,之后,开始检测出根球壳孢菌,但以8月的检测效果为佳。将每次检测到病原菌的PCR产物进行测序,所得序列经BLAST比对后均确定为该病原菌。试验结果表明,根据GenBank库已有的枯斑拟盘多毛孢菌、根球壳孢菌序列,通过其ITS区序列设计特异性引物,对松针、云杉基因组DNA进行PCR扩增的方法来检测松赤枯病、云杉叶疫病是可行的。使用这种方法可以提前两个月检测出松赤枯病病原菌,也可以初步推定二郎山地区云杉落针非云杉散斑壳菌[Lophoderm ium Piceae（Fuckel） V.Hohn]引起而是由根球壳孢菌所致,并发现该地区常见的川西云杉（P. likiangensis）和粗枝云杉（P.asperata）针叶组织中均有根球壳孢菌的存在。该方法可以在病害表现出症状前一定时间内快速准确地检测出病原菌是否存在,对林木病害的提前快速诊断方法与技术进行了有益探索,也为病害的进一步防控措施的拟定提供了依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 林木病害及症状
• 1.2 松赤枯病研究现状
• 1.2.1 病原菌形态特征
• 1.2.2 病原菌生物学特性
• 1.2.3 病害症状
• 1.2.4 病害发生规律
• 1.3 云杉叶疫病研究现状
• 1.3.1 病原菌形态特征
• 1.3.2 病害症状
• 1.3.3 病害发生规律
• 1.4 真菌分类鉴定方法
• 1.4.1 形态鉴定分类方法
• 1.4.2 分子生物学分类方法
• 1.5 传统的林木病害诊断技术
• 1.5.1 形态学检测
• 1.5.2 分离培养检测
• 1.5.3 洗涤检验
• 1.6 分子生物学技术在病原菌检测鉴定上的应用现状
• 1.6.1 巢式PCR
• 1.6.2 竞争PCR
• 1.6.3 多重PCR
• 1.7 引物设计
• 1.7.1 引物设计原理
• 1.7.2 引物设计原则
• 2 研究方案及目的意义
• 2.1 研究方案
• 2.1.1 技术路线
• 2.1.2 具体方案
• 2.2 研究目的和意义
• 2.2.1 研究目的
• 2.2.2 研究意义
• 3 试验研究内容
• 3.1 川西地区松赤枯病病原的快速分子检测
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.2 结果与分析
• 3.1.3 讨论
• 3.2 二郎山地区云杉落针的分子诊断
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 结果与分析
• 3.2.3 讨论
• 4 结论
• 4.1 结论
• 4.2 本研究的创新点及有待进一步解决的问题
• 参考文献
• 致谢
• 附录1：松赤枯病病原菌检测的PCR产物测序及序列比对结果
• 附录2：云杉叶疫病病原检测的PCR产物测序及序列比对结果