玉米幼苗中谷氨酰胺转氨酶的分离纯化及其性质研究

论文摘要

谷氨酰胺转氨酶（TGase）是一种催化酰基转移反应的酶,它广泛存在于动植物组织器官和多种微生物中。动物来源的TGase含量少,纯化工艺复杂,且是Ca2+依赖型,难以得到大规模应用。目前,微生物来源的TGase是研究和应用最多的。然而植物来源的TGase目前报道较少。本研究拟从黄化的玉米叶中纯化得到谷氨酰胺转氨酶、研究其酶学性质、考察TGase在酸奶产品中的应用特性,同时与微生物来源的TGase进行性质比较,进而探索玉米来源的TGase应用于商业化生产中的可行性。首先,以黄化的玉米叶为原料,通过破碎、萃取、超滤浓缩、凝胶过滤层析等步骤分离纯化得到一定纯度的谷氨酰胺转氨酶。在纯化过程中对离心、超滤、凝胶过滤层析中的条件进行了优化。通过优化的条件进行TGase分离,得到的TGase比酶活为27.28 U/g,酶活回收率为13.84%,纯度为3.0%,分子量约为61 kDa。然后,以纯化的玉米TGase为样品,考察了温度和pH值对TGase活性的影响。研究结果表明:玉米TGase的最适温度为35℃,在3045℃范围内具有较高酶活性;玉米TGase的最适pH为9.0,在pH 8.0左右时酶活最为稳定,在pH 8.09.0的范围内具有较高酶活性。另外,通过差示扫描量热法研究其热变性温度,结果表明玉米TGase变性起始温度是46.03℃,相变温度为60.50℃。本研究将玉米TGase和微生物TGase在酸奶发酵前加入到全脂牛乳中,发现加TGase的酸奶产品在坚实度和稠度上明显高于对照组;加玉米TGase的酸奶在粘度和粘滞指数上却低于加微生物TGase酸奶和对照组酸奶。从表观形态上看,添加TGase的酸奶都出现了明显颗粒状凝块。综合本研究结果来看,玉米TGase在温度稳定性方面好于微生物TGase,而在pH值稳定性方面则不如微生物TGase。因此,玉米TGase可以应用在一些对温度要求较严格的食品中,而在某些pH值较低的食品中的应用具有一定的局限性。整体上看,玉米TGase作为一种促使蛋白质交联的催化剂,具有一定的应用潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 立题背景
• 1.2 谷氨酰胺转氨酶的研究现状
• 1.2.1 谷氨酰胺转氨酶的催化作用机理
• 1.2.2 酶活性测定方法研究进展
• 1.2.3 谷氨酰胺转氨酶的分布
• 1.2.4 谷氨酰胺转氨酶分离纯化研究进展
• 1.2.5 谷氨酰胺转氨酶的性质比较
• 1.2.6 谷氨酰胺转氨酶在食品中的应用
• 1.3 本课题研究的目的及意义
• 1.4 本课题主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验原料
• 2.2 药品与设备
• 2.2.1 主要药品与试剂
• 2.2.2 主要仪器及设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 SDS-PAGE
• 2.3.2 酶活测定方法优化
• 2.3.3 MLTG 的分离纯化方法优化
• 2.3.4 MLTG 的性质研究
• 2.3.5 MLTG 在酸奶产品中的应用研究
• 2.3.6 其他分析测定方法
• 2.3.7 数据处理方法
• 第3章 玉米谷氨酰胺转氨酶的分离纯化
• 3.1 玉米叶水分及蛋白质含量
• 3.1.1 湿玉米叶水分含量
• 3.1.2 湿玉米叶全蛋白质含量
• 3.2 酶活测定方法优化
• 3.2.1 MLTG 溶液的最大光吸收波长确定
• 3.2.2 氧肟酸比色法测酶活的条件优化
• 3.3 离心条件对酶的影响
• 3.3.1 离心转速与粗酶液中蛋白质含量和酶活的关系
• 3.3.2 离心时间与粗酶液中蛋白质含量和酶活的关系
• 3.4 超滤条件对酶的影响
• 3.4.1 浓缩倍数与超滤时间之间的关系
• 3.4.2 浓缩倍数对比酶活的影响
• 3.5 凝胶过滤层析条件的确定
• 3.5.1 上样量对酶纯化效果的影响
• 3.5.2 洗脱速度对纯化效果的影响
• 3.6 MLTG 纯度测定
• 3.7 酶的分离纯化汇总
• 3.8 本章小结
• 第4章 玉米谷氨酰胺转氨酶的酶活稳定性研究
• 4.1 酶的最适温度
• 4.2 热处理对酶活稳定性的影响
• 4.2.1 热处理时间对酶活稳定性的影响
• 4.2.2 热处理温度对酶活稳定性的影响
• 4.2.3 DSC 测定蛋白质变性温度
• 4.3 酶的最适pH
• 4.4 酶的pH 稳定性
• 4.5 低温（4℃）条件下酶溶液的酶活变化
• 4.6 本章小结
• 第5章 玉米谷氨酰胺转氨酶的应用特性研究
• 5.1 TGase 对不同底物蛋白的交联作用研究
• 5.1.1 两种来源TGase 对酪蛋白的交联作用
• 5.1.2 两种来源TGase 对牛乳乳清蛋白的交联作用
• 5.1.3 两种来源TGase 对大豆分离蛋白的交联作用
• 5.2 两种TGase 对酸奶品质的影响
• 5.2.1 酸奶样品的制备
• 5.2.2 质构测定
• 5.3 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录
• 附录一 L-谷氨酸-γ-单羟肟酸标准曲线的绘制
• 附录二 牛血清白蛋白标准曲线的绘制
• 致谢