海洋聚磷菌Halomonas YSR-3的除磷特性研究

论文摘要

本论文报道从海洋中分离到的一株聚磷菌的分离、鉴定、在系统发育中的地位、除磷特性、菌体内多磷酸盐颗粒的研究、D-海因酶和核苷二磷酸激酶基因的克隆及序列分析,为海水系统的生物除磷提供部分基础资料。从黄海海域分离到聚磷菌Halomonas sp. YSR-3,菌体呈杆状,大小为3.5μm×1μm,革兰氏阴性,好氧生长,能运动。透射电镜观察发现,菌体内有致密颗粒。经DAPI染色确定该致密颗粒是多磷酸盐,亦可称为异染粒、迂回体。16S rDNA鉴定结果表明,YSR-3与Halomonas属中的marine bacterium B5-7有较高的同源性,相似值99%。YSR-3的生理生化特性:对氯霉素和卡那霉素敏感;淀粉水解呈阳性;反硝化和几丁质降解呈阴性;能将葡萄糖作为唯一碳源和能源。对YSR-3的培养条件进行优化。以海水2216培养基、24℃、180 rpm、pH 6.5的条件培养,更利于菌体生长和菌体内多磷酸盐的形成。对YSR-3的除磷特性进行研究。无磷培养时,菌体不能生长;用磷酸钾盐作为磷源时,菌体生长较好,形成多磷酸盐的菌体比例较高;较适合YSR-3菌体生长和多磷酸盐形成的磷源是KH2PO4,较适磷浓度为1.5 mmol/L。pH的变化影响菌株的生长、多磷酸盐形成和除磷效果。pH值为5时,菌体的数量几乎不增加,体内多磷酸盐和培养基中磷含量变化不大;pH值为6、7和8时,菌体生长良好,95%以上的菌体内形成多磷酸盐,培养基中磷含量明显下降。YSR-3在不同培养基中除磷量和除磷率不同。在高磷培养基中除磷量为0.7 mmol/L（磷含量由1.84 mmol/L降到1.14 mmol/L）,除磷率为37.5%;在低磷培养基中除磷量为0.02 mmol/L（磷含量由0.028 mmol/L降到0.008 mmol/L）,除磷率为72.2%。以海洋聚磷菌Halomonas sp. YSR-3的总DNA为模板,用PCR法扩增D-海因酶基因和核苷二磷酸激酶基因,将扩增片段克隆到pGM-T载体,转化E.coli TOP10菌株,经蓝白斑筛选、菌落PCR得到阳性克隆,测序后对序列进行Blast比对分析。得到的D-海因酶基因序列长度为1510 bp,与Pseudomonas entomophilaL48的海因酶基因序列的相似性为77%。翻译后的序列与Pseudomonas fluorescens Pf-5,Marinomonas sp. MED121,Burkholderia vietnamiensis G4的海因酶蛋白序列相似性分别为75%,73%,70%。得到的核苷二磷酸激酶基因序列长度为420bp,翻译后的序列与Loktanella vestfoldensis SKA53,Jannaschia sp. CCS1,Roseobacter sp. CCS2的核苷二磷酸激酶蛋白序列相似性分别为89%,86%,85%。聚磷菌能将外界环境中的磷吸收到体内,并以多磷酸盐的形式储存。多磷酸盐对于细胞的生存和生长有很重要的作用,但目前对于多磷酸盐的形成过程以及过程调控还不是很清楚。在今后可以通过构建高效表达的重组菌,提高与除磷相关的酶的纯度及活性。同时可以将相关酶的基因进行突变,对基因表达的调控以及酶的代谢以及功能结构等多方面进行基础研究,使聚磷菌在生物除磷中得到广泛应用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 第一节 聚磷菌在生物除磷中的应用
• 1.1 磷对水体的污染及造成的危害
• 1.2 目前主要的除磷方法
• 1.3 生物除磷
• 1.4 生物除磷系统中分子生物学的应用
• 1.5 生物除磷系统中微生物的类群
• 1.6 生物除磷系统中主要微生物的生理特性
• 第二节 聚磷菌形成多聚物的种类及其染色方法
• 2.1 聚磷菌形成多聚物的种类
• 2.2 聚磷菌细胞内多聚物的染色方法
• 第三节 聚磷菌体内多磷酸盐的功能及其代谢酶
• 3.1 多磷酸盐在细胞中的形成
• 3.2 多磷酸盐的功能
• 3.3 与多磷酸盐代谢相关的酶
• 第二章 海洋聚磷菌HALOMONAS YSR-3的分离纯化和培养条件优化
• 第一节 菌株YSR-3 的分离纯化和电镜观察
• 1.1 样品来源
• 1.2 海洋聚磷菌的富集
• 1.3 海洋聚磷菌的分离纯化
• 1.4 菌株YSR-3 的电镜观察
• 第二节 菌株YSR-3 的生长曲线
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 第三节 菌株YSR-3 生长的最适氯化钠浓度、温度和起始PH 值
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四节 本章小结
• 第三章 海洋聚磷菌HALOMONAS YSR-3体内多磷酸盐颗粒的研究
• 第一节 细胞内致密颗粒组分的确定
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果与讨论
• 第二节 培养基中磷源对YSR-3 生长及磷吸收量的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 第三节 几种铁源对YSR-3 生长及磷吸收量的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与讨论
• 第四节 磷酸高铁浓度对YSR-3 生长及磷吸收量的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与讨论
• 第五节 菌体生长、磷吸收量和形成多磷酸盐颗粒的关系
• 5.1 材料和方法
• 5.2 结果与讨论
• 第六节 本章小结
• 第四章 海洋聚磷菌HALOMONAS YSR-3 的特性
• 第一节 菌株YSR-3 的生理生化特性、抗生素抗性
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果与讨论
• 第二节 菌株YSR-3 的165 RDNA 序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 第三节 菌株YSR-3 的除磷特性
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四节 本章小结
• 第五章 海洋聚磷菌HALOMONAS YSR-3 的D-海因酶和核苷二磷酸激酶基因的克隆及序列分析
• 第一节 D-海因酶基因的克隆及序列分析
• 1.1 材料和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 第二节 核苷二磷酸激酶基因的克隆及序列分析
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 第三节 本章小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 课题资助
• 发表文章目录
• 致谢