银杏萜内酯代谢途径中关键酶基因的遗传转化研究

论文摘要

银杏萜内酯,包括银杏内酯和白果内酯,是在银杏提取物中起着主要作用的有效药用成分,其独特的生理作用和治疗价值在世界医疗行业引起了极大兴趣。然而,银杏萜内酯在银杏中含量较低,且银杏的细胞培养系很少产银杏萜内酯。由于不断扩大的银杏制品的市场需求和有限的银杏树资源,用基因工程技术修饰银杏萜内酯生物合成途径已成为提高银杏萜内酯含量最具潜力的方法之一。法尼基焦磷酸合成酶（FPS）是异戊烯基转移酶中的一种,它催化一分子的二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）和两分子的异戊烯基焦磷酸（IPP）缩合生成法尼基焦磷酸（FPP）。FPP是植物体内甾体、皂苷、倍半萜、橡胶等许多萜类衍生物质的合成前体。在银杏中,FPP为合成白果内酯合成提供前体,同时也为香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的生成提供直接前体,而GGPP是包括银杏内酯在内的所有二萜类化合物的共同前体。1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸还原酶（HDR）是MEP途径末端的酶,以5:1的比例同时把1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸（HMBPP）转化成IPP和DMAPP的混合物,为银杏萜内酯的生物合成提供了异戊烯前体。FPS和HDR都是银杏内酯合成途径中的关键酶。因此,fps基因和hdr基因也成为了研究银杏内酯代谢工程的两个潜在靶点。为了研究FPS和HDR对银杏愈伤中银杏内酯含量的影响,我们基于pCAMBIA1304载体构建了两个单基因表达载体,分别是载体p1304+Gbfps和载体p1304+Gbhdr。采用根癌农杆菌介导法,分别将Gbfps和Gbhdr转化银杏种子胚。通过潮霉素（10mg/L）筛选,分别获得了32个和8个抗性愈伤组织系,PCR检测表明其中分别有30个和7个为转基因愈伤组织系。采用HPLC-ELSD法分别对转Gbfps的22个愈伤组织和转Gbhdr的4个愈伤组织中的银杏总内酯含量进行了测定。结果显示,转Gbfps的愈伤组织系f-6中银杏总内酯含量相比非转基因系有大幅提高,达到非转基因系的4.4倍,转Gbhdr的愈伤组织系h-8中银杏总内酯含量达到非转基因系的2.5倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 银杏萜内酯的结构和作用
• 1.1.1 银杏萜内酯的结构
• 1.1.2 银杏萜内酯的药理作用
• 1.2 银杏内酯的制备方法
• 1.2.1 天然提取法
• 1.2.2 化学合成法
• 1.2.3 细胞培养法
• 1.3 提高银杏组织培养物中银杏萜内酯含量的研究进展
• 1.3.1 优化培养条件
• 1.3.2 加入前体物质
• 1.3.3 化学或生物诱导子
• 1.4 银杏萜内酯生物合成途径研究进展
• 1.4.1 银杏萜内酯生物合成的上游途径
• 1.4.2 银杏萜内酯生物合成的下游途径
• 1.5 银杏的遗传转化和银杏萜内酯代谢工程
• 第二章 银杏叶及愈伤组织中银杏萜内酯含量测定的方法建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 仪器和试剂
• 2.1.3 高效液相操作流程
• 2.1.4 样品提取方法
• 2.1.5 色谱条件
• 2.1.6 标准曲线
• 2.1.7 精密性实验
• 2.1.8 重复性实验
• 2.1.9 加样回收率实验
• 2.2 结果和讨论
• 2.2.1 标准曲线的制作
• 2.2.2 精密性
• 2.2.3 重复性
• 2.2.4 加样回收率
• 2.2.5 讨论
• 第三章 银杏中Gbfps基因的遗传转化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 农杆菌工程菌株
• 3.1.3 植物表达载体
• 3.1.4 设备与仪器
• 3.1.5 银杏转化中所用到的培养基
• 3.1.6 银杏fps基因编码区的克隆
• 3.1.7 植物表达载体pCAMBIA1304+Gbfps的构建
• 3.1.8 农杆菌EHA105的转化
• 3.1.9 根癌农杆菌EHA105介导转化银杏胚
• 3.1.10 抗性愈伤组织DNA的提取及PCR检测目的基因
• 3.1.11 独立转化子中Gbfps的表达分析
• 3.1.12 转基因银杏愈伤中萜内酯含量测定
• 3.2 结果和讨论
• 3.2.1 带NcoⅠ/BstEⅡ酶切位点的Gbfps基因编码区的扩增
• 3.2.2 单基因植物高效表达载体p1304+Gbfps的构建
• 3.2.3 农杆菌介导p1304+Gbfps遗传转化银杏幼胚
• 3.2.4 PCR检测
• 3.2.5 RealTime PCR检测目的基因表达量
• 3.2.6 HPLC—ELSD检测银杏萜内酯含量
• 3.2.7 讨论
• 第四章 银杏中Gbhdr基因的遗传转化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 农杆菌工程菌株
• 4.1.3 植物表达载体
• 4.1.4 设备与仪器
• 4.1.5 银杏转化中所用到的培养基
• 4.1.6 根癌农杆菌EHA105介导转化银杏胚
• 4.1.7 抗性愈伤组织DNA的提取及PCR检测目的基因
• 4.1.8 半定量RT-PCR检测目的基因的表达
• 4.1.9 转基因银杏愈伤中萜内酯含量测定
• 4.2 结果和讨论
• 4.2.1 农杆菌介导p1304+Gbhdr遗传转化银杏幼胚
• 4.2.2 抗性愈伤组织的PCR检测
• 4.2.3 HPLC—ELSD检测银杏萜内酯含量
• 4.2.4 半定量RT-PCR检测
• 4.2.5 讨论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢