论文摘要
禽流感是由禽甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病。1997年在中国香港发生了全球首起人感染禽流感事件,引起了人们对禽流感的普遍关注。近年禽流感大流行导致数以百万计的家禽死亡。已有100多个国家和地区发生了高致病性H5N1型禽流感（人禽流感）病毒对人类的感染,其病例达400余例,死亡262人。禽流感病毒的传播已突破物种间屏障,获得了直接感染人的能力,给人类健康带来巨大威胁。目前,尚无完全有效的预防和治疗人禽流感的技术手段。因此,寻找有效预防和治疗人禽流感的策略与技术手段一直是传染病学界近年在人禽流感研究方面的努力方向和工作重点。H5N1病毒借助其包膜表面的血凝素（hemagglutinin, HA）蛋白与宿主细胞表面受体结合,以进入宿主细胞,而HA同时也是宿主产生中和抗体的重要靶抗原。作为溶细胞病毒的高致病性禽流感H5N1病毒,其中和抗体能有效地保护机体免于病毒感染。因此,寻找H5N1的中和抗原表位是禽流感病毒中和抗体制备及免疫治疗研究的重要前提。本研究首先对H5N1的中和抗原表位进行了研究。我们利用得到的四株H5N1 HA基因,即香港（人）株A/Hongkong/213/03 H5N1 HA （HK HA）.安徽（人）株A/Anhui/01/05 H5N1 HA （AH HA）、新疆（人）株A/Xinjiang/01/06 H5N1 HA （XJ HA）和青海（禽）株A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05 H5N1 HA （QH HA）进行了中和抗原表位的研究与鉴定。通过对QH HA、XJ HA、AH HA和HK HA的分子流行病学和分子生物学的研究,发现QH H5N1和XJ H5N1属于Clade 2.2; AH H5N1属于Clade 2.3.4; HK03 H5N1属于Clade 1。这些毒株涵盖了高致病性人禽流感H5N1病毒在我国流行的主要分枝。通过杆状病毒真核蛋白表达系统表达并纯化HA蛋白,依次制备了针对HK-HA, XJ-HA和QH-HA的单克隆抗体,并鉴定了其中和抗体活性。共筛选出42株分泌高亲合力单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中6株单克隆抗体具有部分交叉中和活性。利用合成的11条针对HA不同区域的6个氨基酸短肽,通过肽阻断竞争ELISA法寻找抗体结合区域。结果显示,大多数抗体和全部中和抗体的结合区域都集中在HA蛋白89-160氨基酸区域。利用涵盖这些区域的20个氨基酸长肽免疫小鼠,取免疫小鼠血清进行中和试验,验证中和抗原表位。结果显示,89-99和124-134氨基酸区域的合成肽免疫的小鼠血清效价最高,并且具有部分交叉中和活性,故可认定这两个区域为HA的中和抗原表位。第二,本研究以病毒的特异性和交叉性作为探讨禽流感病毒跨物种传播规律的主线。围绕以下三个问题开展对高致病性人禽流感病毒HA蛋白变异规律的研究。这些问题包括：一是中和抗体在病毒跨物种传播过程中的作用是什么?二是抗体的选择压力和受体的适应性,哪一个是禽流感病毒突变的最初驱动力?三是中和抗体在禽流感病毒跨物种传播中如何发挥作用的?利用从中国疾病控制中心和中国科学院获得的10例H5N1病毒疫苗免疫和感染的人血清和4例H5N1病毒感染野鸟血清,观察感染或疫苗免疫人群之间以及感染或疫苗免疫人群与感染鸟类之间的免疫原性的异同与血清学交叉反应表现。根据基因序列比对结果,通过点突变方法,改变具有4个氨基酸差异的两个分别来自于人和禽的H5N1 HA基因QH-HA和XJ-HA的序列,在假病毒水平和蛋白水平观察抗体对突变体中和能力和结合能力变化,寻找跨物种传播的关键位点。结果显示,虽然H5N1感染或免疫人血清对禽源QH株假病毒有较高的中和能力,但其对QH-HA的结合较低,而对人源HA都有较高中和及结合能力,提示H5N1感染或免疫人血清中的抗HA抗体呈现明显的种属特异性。H5N1感染鸟血清对QH和HK假病毒和其HA蛋白的中和及结合能力都较高,H5N1感染鸟血清中抗HA抗体呈现明显的分枝交叉性。通过对QH与XJ HA基因不同氨基酸的比较,发现90位点及其毗邻的HA裂解区域的氨基酸改变,可以导致受体结合域构象改变使抗体亲合力和中和活性降低。通过肽阻断试验,发现89-99氨基酸区域是抗体结合的高亲和区域。比较突变体假病毒对人源和禽源细胞感染效率,发现90位氨基酸突变可导致QHH5N1假病毒感染效率发生由禽向人的转变；160位氨基酸变异不能引起HA构象的改变但却可以导致QH H5N1假病毒感染效率发生由禽向人的转变。90位氨基酸不位于HA受体结合域,但该部位的突变却可以改变HA的种属特异性,因此我们推测该位点的突变由抗体介导产生,抗体是介导病毒变异的最初驱动力,而且远离HA蛋白头端的与HA2亚单位相连的区域为突变最早的部位,比如90位氨基酸突变。同时受体的适应性也促进了病毒与宿主的相互适应,最终导致H5N1病毒在新物种中稳定传播,比如160位氨基酸突变。作为人类社会附属品的家禽和牲畜,因其长期与人类的接触,导致它们的抗体识别谱与人类相似,因此,家禽中的类人类的抗体环境可能是禽流感病毒获得向人传播倾向性的主要原因。由抗体选择压力引起的变异为HA的关键变异,因此,加强家禽中的禽流感病毒对这些关键位点变异的检测,有利于人禽流感病例的预防。综上所述,本研究取得了以下主要创新性学术成果：1、建立了一个采用基于表位肽结合特性的ELISA技术,是鉴定不同单克隆抗体结合区域的新的有效方法；2、利用昆虫病毒表达系统所表达的具有天然蛋白生物学活性的HA蛋白以及相关技术,首次发现中国境内流行株H5N1 HA蛋白的两个重要中和抗原表位区域,为禽流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础,该成果已经申请了发明专利；3、验证了抗体在禽流感病毒变异过程中的重要作用,发现了病毒变异方向是由产生高亲合力的非中和抗体向产生中和抗体方向变异,并揭示了此过程中存在有两种重要的突变方式：逃逸抗体中和和获得受体适应的突变以及家禽中的类人类的抗体环境是诱导禽流感病毒向人方向适应变异的主要原因。
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