论文摘要
目的:胃肠动力障碍（Gastrointestinal motility disturbances,GMD）是危重症的常见并发症,常伴发肠道粘膜屏障通透性增高和细菌易位,是导致创伤性脑损伤（traumatic brain injury, TBI）等危重患者对肠内营养不耐受,发生返流、呕吐、腹胀等不良反应,引发吸入性肺炎、严重营养不良、脓毒血症和多器官功能衰竭等并发症的重要原因,因此积极改善TBI后GMD将有益于降低患者的ICU住院日,改善预后。危重症的GMD常表现为胃窦动力不足、胃排空延迟、迁移型复合波减少等,其发生发展与神经激素调节、炎症介质释放等多种因素相关。因此,胃肠运动功能调节成为关注的热点。胃肠道与心脏相似都具有自主节律性运动,心脏的自主节律性来源于窦房结的自发性电活动,而近年来研究发现,胃肠道的自主节律性运动由Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal,ICC）自发性电活动——慢波（slow wave）诱导,同时ICC也是慢波的传导者和肠神经作用的首要靶点,在调控胃肠运动中具有重要作用。已有研究证实, ICC网络的受损、异常、增生或缺失都会导致胃肠慢波异常,从而引起胃肠动力障碍或疾病。此外,胃肠动力与胃肠道神经系统和平滑肌细胞密切相关。乳酸菌是益生菌的重要组成成分,广泛存在于人体的皮肤、口腔、胃肠道、泌尿生殖道内。有研究证实乳酸菌可抑制肠道炎症反应,促进肠上皮细胞增生,维护肠黏膜屏障的完整性,改善肠道菌群紊乱,降低内毒素和脓毒血症的发生率;近来还发现其对胃肠动力紊乱具有改善作用,可用于治疗急慢性腹泻、便秘、腹胀、功能性消化不良等。课题组前期研究也发现乳酸菌可改善脑损伤后胃肠动力障碍,但是机制不明。本课题拟在前期研究基础上,探讨脑损伤后小肠收缩运动和ICC的变化以及乳酸菌对脑损伤后肠收缩运动和ICC的调节作用及可能机制,为改善危重症后的胃肠动力障碍奠定基础。方法:按随机数字表法将昆明小鼠分为假伤C组、肠内营养EN组、乳酸菌P组。创伤后4h左右,C、EN组小鼠给予普通肠内营养,P组将乳酸菌溶于普通肠内营养中喂养。颅脑损伤小鼠摄入热量:按732.2KJ/kg·d的标准,30～40g的昆明小鼠,每天需要热量22.0～29.3KJ。普通肠内营养使用聚洋全营素(（大坪医院野战外科研究所营养科研制）。乳酸菌制剂选用:Probiotics 2000TM（瑞典,Medipham）,其主要成分为:植物乳杆菌（lactobacillus plantarum 2362）、干酪乳杆菌（lactobacillus casei ssp paracasei 19）、棉子糖明串株菌（leuconostoc raffinolactis 23-77:1）、戊糖片球菌（pediococcus pentosaceus 16:1）。总含菌量不低于1011cfu/g。每只小鼠喂养量不低于1x1010cfu/d。在创伤后1d、3d、7d分别收集各组小鼠的末端回肠组织、粪便等进行指标检测,通过观察脑损伤小鼠离体平滑肌收缩运动,小肠ICC数量和超微结构,小鼠排便量和体重等的变化,探讨脑损伤后肠收缩运动和肠ICC的变化以及乳酸菌对脑损伤后肠ICC的调节作用,同时还检测肠道炎症因子和c-kit蛋白等含量,进一步探讨作用可能机制。数据均以均数加标准差（ˉx±s）表示,统计学处理采用SPSS 13.0统计软件包进行单因素方差分析,以P﹤0.05为有统计学差异。结果:1.乳酸菌对TBI后小肠收缩运动的影响（1）收缩模式:假伤组各时相点肌条收缩规律且整齐,放大5倍后波形为光滑（波谷和波峰为光滑曲线）的正弦波或余弦波;同假伤组比较,TBI后肠内营养组1d、3d、7d肌条收缩模式紊乱不规律,出现时高时低的波动,甚至波幅消失,且放大5倍后可观察到波谷和波峰出现尖锐化;乳酸菌组相对假伤组肌条收缩模式有不同程度的紊乱,但相对肠内营养组,各时相点运动模式较规律,波幅明显增大,放大5倍后波形连续,多数波峰和波谷光滑,少数呈尖锐化。（2）收缩幅度:与假伤组相比,TBI后肠内营养组各时相点平滑肌收缩幅度明显降低（P<0.01）,而乳酸菌喂养组除1d明显降低外（P<0.05）,3d、7d已与假伤组无统计学差异（P>0.05）;和肠内营养组相比,乳酸菌组除1d无显著差异外,3d、7d均显著高于肠内营养组（P<0.01）。（3）收缩频率:与假伤组相比,TBI后肠内营养组各时相点平滑肌收缩频率显著减少（P<0.01或P<0.05）,而乳酸菌组除1d、3d无显著差异外,7d收缩频率显著增多（P<0.05）;和肠内营养组相比,乳酸菌组1d、3d无显著差异,7d组平滑肌收缩频率显著高于肠内营养组（P<0.01）。（4）平均张力:与假伤组相比,TBI后肠内营养组1d平滑肌收缩平均张力明显降低（P<0.01）,3d、7d无显著差异,而乳酸菌喂养组1d、7d平均张力降低（P<0.01）,3d与假伤组无统计学差异;和肠内营养组相比,乳酸菌组各时相点平滑肌收缩平均张力均无统计学差异。2.乳酸菌对TBI后ICC的影响及其可能机制2.1末端回肠肠肌丛ICC（ICC-MY）数量及其网状结构的观察（1）ICC-MY网状结构:激光共聚焦显微镜观察假伤组ICC-MY其形态表现为多极性,形成多个分支,彼此交织,形成“鱼网状”紧密细胞间网状结构。TBI后,肠内营养组3d、7d网络明显变稀薄,分支减少,而乳酸菌组网络相对肠内营养组变稠密,但仍未达到假伤组水平。（2）ICC-MY细胞数量:与假伤组相比,TBI后,肠内营养组末端回肠ICC-MY细胞数量明显减少（P<0.05或P<0.01）,乳酸菌组除3d无统计学差异外,1d、7d末端回肠ICC-MY细胞数量明显减少（P<0.01）;与肠内营养组相比,乳酸菌组除1d无显著差异外,3d、7d细胞数量均明显增多（P<0.05）。2.2 ICC及其周围平滑肌组织的超微结构的观察假伤组（1d、3d、7d）:ICC细胞呈纺锤形,有巨大的卵圆形核及向外伸展的长突起,胞质内有丰富的线粒体、大量粗面内质网和光面内质网,ICC-MY走行于神经细胞和纵行、环形平滑肌细胞之间。ICC与平滑肌细胞及平滑肌细胞之间形成突触样连接,也可见ICC、神经元细胞以及平滑肌细胞之间相互形成缝隙连接;平滑肌细胞胞质非常丰富,可见密体和密斑等成分,存在线粒体和高尔基复合体,突起部分主要为细丝,细胞外可见完整的基膜;神经元细胞线粒体正常无肿大坏死等。肠内营养组（1d、3d、7d）:可见ICC胞质溶解,胞浆减少,电子密度降低,胞质内细胞器减少,也可见较多透明小泡,线粒体破坏严重,线粒体固缩变性、髓鞘样结构形成,内质网扩张,细胞膜破损。最显著的变化是ICC与平滑肌细胞、平滑肌细胞之间间隙增宽,缝隙连接减少;平滑肌损伤严重,细胞内线粒体肿胀,胞质溶解,电子密度降低,出现大量透明小泡,髓鞘样结构形成;神经元核固缩,胞体缩小变形,神经元肿胀、变圆,胞浆着色浅而呈苍白均质状。乳酸菌组（1d、3d、7d）:ICC细胞形态基本正常,可见高尔基复合体、内质网和线粒体等丰富的细胞器,线粒体基本正常或轻度肿胀,可见多量透明小泡。ICC细胞核内出现异染色质,细胞核核周间隙轻微增宽,细胞膜有破损;平滑肌细胞胞浆较丰富,含丰富线粒体,胞浆内可见大量的透明小泡;神经元纤维之间出现空洞,少数神经元变圆、胞体缩小变形。超微结构改变也可见ICC、神经元细胞与平滑肌细胞的间隙增宽,缝隙连接减少。ICC细胞、平滑肌和神经细胞内部结构在各时相点较肠内营养组均有一定的改善;在伤后7d,可见ICC与平滑肌细胞、平滑肌细胞之间可见缝隙连接增多。2.3末端回肠组织匀浆c-kit蛋白的表达与假伤组相比,肠内营养组末端回肠c-kit蛋白条带明显变细变弱,说明TBI后,小肠c-kit蛋白表达降低;而乳酸菌组相对肠内营养组,条带变黑变粗,说明乳酸菌处理后,c-kit蛋白表达增多。2.4末端回肠组织匀浆IL-1β含量的检测与假伤组相比,TBI后1d、3d、7d,肠内营养组末端回肠组织IL-1β含量明显增高（P<0.01）,乳酸菌组各时相点均无显著差异;与肠内营养组比较,乳酸菌组各时相点IL-1β含量均显著降低（P<0.01）。3.整体性指标3.1小鼠排便量与假伤组相比,TBI后,肠内营养组各时相点小鼠大便量均显著降低（P<0.05或P<0.01）,乳酸菌组除1d无显著差异外,3d、7d小鼠大便量均显著减少（P<0.01）。与肠内营养组相比,乳酸菌组除3d外,其余时相点小鼠大便量均显著增多（P<0.01）。3.2小鼠体重变化建模前和建模后4h,各组的小鼠体重无差异（P>0.05）。在术后1d、3d、7d小鼠体重均有不同程度的降低,但是假伤组小鼠3d后体重下降趋势开始减缓。与假伤组体重减少值相比,TBI肠内营养组1d后体重减轻更明显,直到7d后仍无明显改善（P<0.05或P<0.01）,而乳酸菌组,在1d、3d与假伤组无显著差异,7d后减轻高于假伤组水平（P<0.01）。肠内营养组和乳酸菌组体重减少量在各时相点无统计学差异。结论:1.创伤性脑损伤小鼠小肠收缩运动1d后即出现受损,收缩幅度、频率、平均张力降低,收缩模式紊乱不规律,直到第7d仍未完全恢复。可能与ICC、平滑肌和神经细胞的损伤有关。2.创伤性脑损伤小肠肠肌丛ICC数量减少,ICC网络结构破坏,超微结构损伤,这可能是导致脑损伤后动力障碍的重要因素。3.乳酸菌可以促进小肠收缩运动的恢复,可能与其降低脑损伤后肠道炎症,促进ICC、平滑肌和神经细胞的修复有关。4.乳酸菌可以促进小肠ICC的恢复,可能与乳酸菌能减轻脑损伤后平滑肌和肠神经的损伤、增加肠c-kit蛋白表达和抑制肠道炎症介质的过度释放有关。