论文摘要
目前,土壤盐渍化是制约农业生产的一个全球性问题,盐害严重影响植物的生长发育,造成作物减产。因此,提高作物的耐盐能力已经成为现代植物育种工作急需解决的关键问题,其中,转基因研究为人工改良作物提供了更多的可能性。目前基因工程领域主要通过改变植物本身基因表达水平或引入外源耐盐基因来进行作物的人工改良。而植物耐盐相关基因的克隆、鉴定,并加以利用,己成为此研究的热点。本文所要研究的两个基因就是与耐盐有关。我们根据网上的一部分信息推测TaRSP（Triticum asetivum Root Specific Protein）基因和TA-pSRP（Triticum asetivum putative syntaxin-related protein）基因为小麦中两个耐盐相关基因。在前人研究工作的基础上,我们对其耐盐功能进行了鉴定,以期为小麦耐盐基因工程的开展做一些有益的探索。1. TaRSP基因含有381bp的完整开放阅读框,编码126个氨基酸。生物信息学预测表明TaRSP基因含有一个HPSlike保守结构域。定量PCR结果表明, TaRSP基因为主要在根部表达的基因,并且小麦根部在盐胁迫后的TaRSP基因表达量出现增强。依次可以初步推测该基因是与耐盐有关的基因。为了进行TaRSP蛋白的亚细胞定位,将TaRSP基因与gfp基因构建成融合表达载体,转化拟南芥筛选获得纯合转基因植株。通过对拟南芥纯合转基因植株的根部细胞进行共聚焦观察,结果表明,TaRSP基因纯合转基因植株的荧光主要位于细胞质膜和细胞核中,转入gfp基因的对照植株的荧光分布在细胞质,细胞核和细胞膜的部位,因此推测TaRSP基因的表达产物主要定位于细胞质膜和细胞核上。为了进一步确定TaRSP基因的耐盐功能,我们构建了植物表达双元载体,通过浸花法转化拟南芥植株,对获得的单拷贝插入转基因植株进行了耐盐性鉴定,在盐胁迫条件下,分别对转基因幼苗根生长情况以及完整植株的耐盐性进行检测。结果表明,在含有200mM NaCl MS培养基上,转基因拟南芥植株生长状态和成活率明显好于对照植株,并且TaRSP基因的过量表达可以明显增强盐胁迫下转基因植株幼苗根的正常生长,进而提高整体植株的耐盐性。因此,推测TaRSP基因在植物耐盐中起着十分重要的作用。为了确定TaRSP在非生物胁迫信号通路中的作用,我们对拟南芥各个胁迫信号通路上已知的一些基因进行了定量PCR分析,以期确定其在信号通路中所处的位置。在过表达TaRSP基因的转基因拟南芥中,ADH基因表达明显增加,RD29B, KIN2, FRY1,SAD1基因表达也是上调的,但变化不明显,其余基因表达均有不同程度的降低。因此我们推测TaRSP基因可能在ADH基因的上游。2. TA-pSRP基因含有909bp的完整开放阅读框,编码302个氨基酸。生物信息学预测表明TA-pSRP基因含有一个SynN保守结构域和一个tSNARE结构域。对TA-pSRP基因所编码的蛋白进行NLS预测,发现其主要定位在高尔基体。定量PCR结果显示,经NaCl,PEG处理后,小麦根部TA-pSRP基因的表达量是上调的。依次可以初步推测该基因是与耐盐有关的基因。为了进一步确定TA-pSRP基因的耐盐功能,我们构建了植物表达双元载体,通过浸花法转化拟南芥植株,对获得的纯合体植株进行了耐盐性鉴定,对盐胁迫条件下,分别对转基因植株的幼苗根生长情况以及完整植株的耐盐性进行检测。结果表明,在含有200mM NaCl MS培养基上,转基因拟南芥植株生长状态和成活率明显好于对照植株,并且TA-pSRP基因的过量表达可以明显增强盐胁迫下转基因植株幼苗根的正常生长,进而提高整体植株的耐盐性。因此,推测TA-pSRP基因在植物耐盐中起着十分重要的作用。为了确定TA-pSRP在非生物胁迫信号通路中的作用,我们对拟南芥各个胁迫信号通路上已知的一些基因进行了定量PCR分析,以期确定其在信号通路中所处的位置。在过表达TA-pSRP基因的转基因拟南芥中,COR15a,ADH,FRY1和SAD1基因表达明显增加,RD29B,KIN2基因表达也是上调的,但变化不明显,其余基因表达均有不同程度的降低。因此我们推测TA-pSRP基因可能在COR15a,ADH,FRY1和SAD1基因的上游,通过磷脂酶途径和CDPK途径参与渗透胁迫的调节。