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三株猪胸膜肺炎放线杆菌apx基因缺失株生物学特性和免疫原性研究

2020-12-15阅读(944)

三株猪胸膜肺炎放线杆菌apx基因缺失株生物学特性和免疫原性研究

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的高度接触性传染病。该病严重危害养猪业的发展,APP弱毒疫苗具有能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答的优点,对APP基因缺失弱毒疫苗研究是本病疫苗研究的重要方向。本实验深入进行了对已经构建的三株APP基因缺失株的生物学特性和免疫原性研究,研究内容和结果如下：1、APP不同基因缺失株生物学特性的研究以APP血清7型基因缺失株apxIIC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+.和APP血清5型的基因缺失株SW1△ⅠC为研究对象,进行其不同基因缺失株的生物学特性测定。NAD依赖性测定：将基因缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC单菌落接种到10mL的TSB+NAD培养基中,37℃,300 r/min培养18h,同时设TSB培养基为对照组。结果显示三株基因缺失株在TSB+NAD培养基中生长良好,在不含NAD的TSB培养基中不生长。结果表明三株基因缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/IN+和SWl△ⅠC在体外生长均具有NAD依赖性。生长特性测定：将基因缺失株SW1△ⅠC.apxIIC-/kan+、apxⅡC-/IN+单菌落接种到TSB+NAD培养基中震荡培养10 h,第二天将上述菌液以1：1000的稀释度接种于新的TSB+NAD培养基中,每小时测定其OD600值,并绘制生长曲线,同时设亲本株APP-5和APP-7为对照组。试验结果为亲本株APP-5和缺失株SW1△ⅠC的生长曲线差异不显著；亲本株APP-7和缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+的生长曲线差异不显著。结果表明缺失株与其亲本株的生长特性无明显差异,进一步揭示apxⅠC基因或apxⅡC基因的缺失不影响亲本株APP-5或APP-7的生长。溶血性试验测定：在兔血平板上测定apxⅡC-/kan+、apxIIC-/ⅠN+和SW1△ⅠC的溶血活性,设APP-5.APP-7为阳性对照,DH5α为阴性对照。结果显示在血平板上,APP三株基因缺失株均无溶血环产生,而APP-5菌株和APP-7菌株均有明显溶血环产生,试验表明APP三株基因缺失株apxIIC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC均失去了溶血活性,进一步揭示APP缺失apxⅠC或apxⅡC基因后,能明显降低其溶血活性。细胞毒性试验测定：将基因缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△IC的上清液接到恒河猴胚胎肾细胞（MA-104）,24 h后在倒置显微镜下观察其细胞形态,设TSB培养基为对照组。结果显示接种缺失株SW1△ⅠC菌液上清细胞形态正常,无明显细胞病变；接种缺失株apxⅡC-/kan+和apxⅡC-/ⅠN+菌液上清的细胞有少量的死亡,有较轻细胞病变。结果表明缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC上清液对细胞毒性均减弱,且SW1△ⅠC减弱最为明显。小鼠毒力试验测定：将缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC腹腔接种小鼠,记录小鼠3天后的死亡情况,计算LD50的值,设APP-5型菌株、APP-7型菌株为对照。试验结果为与APP-7相比,缺失株apxⅡC-/kan+的毒力降低了约5倍,缺失株apxⅡC-/ⅠN+的毒力降低了约7倍；与亲本株APP-5相比,缺失株SW1△ⅠC的毒力降低了约15倍。结果表明三株缺失株的毒力降低明显,进一步揭示毒素apxⅠ比毒素apxⅡ毒力强。2、APP不同基因缺失株小鼠的免疫效力试验将缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC分别免疫6周龄雌鼠,共免疫三次,每次免疫间隔两周。于免疫前、一免两周、二免两周和三免两周断尾采血并分别检测毒素ApxI和ApxⅡ的ELISA抗体水平。结果显示,缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC均能够产生较高的毒素抗体。TSB对照组的小鼠在整个试验过程中血清抗体均呈阴性。三免两周后,分别用10LD50和20LD50APP血清1、5、7型菌攻毒。缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC均对APP血清1、5、7型菌（10LD50）攻毒的小鼠保护率为100%；缺失株apxⅡC-/kan+对血清1、5型菌（20LD50）攻毒保护率均为25%,对血清7型菌（20LD50）攻毒保护率为62.5%；缺失株apxⅡC-/ⅠN+对血清1、5、7型菌（20LD50）攻毒保护率均为50%；SW1△ⅠC对血清1型菌（20LD50）攻毒保护率为37.5%,对血清5型菌（20LD50）攻毒保护率为100%,对血清7型菌（20LD50）攻毒保护率为50%。小鼠免疫试验结果初步显示,缺失株apxⅡC-/kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1△ⅠC对同源血清型和异源血清型菌均有保护效力,且SW1△ⅠC缺失株对小鼠的保护力优于apxⅡC-/kan+和apxⅡC-/ⅠN+缺失株。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 符号说明
  • 第一部分 文献综述
  • 1. 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的病原学
  • 1.1 胸膜肺炎放线杆菌的培养特性及血清分型
  • 2. 猪传染性胸膜肺炎的流行及其危害
  • 2.1 猪传染性胸膜肺炎流行现状
  • 2.2 猪传染性胸膜肺炎的危害
  • 3. 猪传染性胸膜肺炎的临床症状和病理变化
  • 4. 猪传染性胸膜肺炎的防制
  • 5. 猪胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究进展
  • 5.1 荚膜（capsule,CP）
  • 5.2 脂多糖（1ipopolysaccharide,LPS）
  • 5.3 外膜蛋白（outer membrane proteins,OMP）
  • 5.4 转铁结合蛋白（transferrin binding proteins,TBP）
  • 5.5 蛋白酶（proteases）
  • 5.6 外毒素（RTX-toxins,Apx）
  • 6. 猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展
  • 6.1 灭活疫苗
  • 6.2 亚单位疫苗
  • 6.3 ghosts疫苗
  • 6.4 口服疫苗
  • 6.5 弱毒活疫苗
  • 7. APP突变株构建方法的研究进展
  • 7.1 自然突变
  • 7.2 化学诱变
  • 7.3 分子生物学方法
  • 8. 研究目的及意义
  • 第二部分 实验研究
  • 1. 试验材料
  • 1.1 菌株、细胞和培养条件
  • 1.2 主要药品及试剂
  • 1.3 培养基及抗生素配制
  • 1.4 引物
  • 1.5 主要仪器
  • 1.6 实验动物
  • 2. 试验方法
  • 2.1 细菌活化
  • 2.2 基因缺失弱毒株的PCR鉴定
  • 2.3 缺失株生物学特性的研究
  • 2.4 缺失株对小鼠的毒力试验
  • 2.5 攻毒后小鼠肺脏病理变化
  • 2.6 缺失株对小鼠免疫保护力试验
  • 2.7 ELISA检测方法的建立及抗体的检测
  • 2.8 MTT法脾淋巴细胞增殖试验
  • 3. 结果与分析
  • 3.1 基因缺失株的PCR鉴定
  • -/kan+的鉴定'>3.1.1 缺失株apxⅡC-/kan+的鉴定
  • -/IN+的鉴定'>3.1.2 缺失株apxⅡC-/IN+的鉴定
  • 3.1.3 缺失株SW1ΔIC的鉴定
  • 3.1.4 缺失株的遗传稳定性试验
  • 3.2 缺失菌株生物学特性的研究
  • 3.2.1 NAD依赖性试验
  • 3.2.2 缺失株生长特性试验
  • 3.2.3 缺失株的溶血活性试验
  • 3.2.4 缺失株的细胞毒性试验
  • 3.3 缺失株对小鼠的毒力试验
  • -/kan+和apxⅡC-/IN+毒力试验'>3.3.1 缺失株apxⅡC-/kan+和apxⅡC-/IN+毒力试验
  • 3.3.2 缺失株SWIΔIC毒力试验
  • 3.4 缺失株对小鼠的免疫保护力试验
  • 3.4.1 缺失株对小鼠的保护试验
  • 3.4.2 毒素ELISA条件的确定
  • 3.4.3 免疫小鼠血清抗体检测
  • 3.5 免疫后小鼠肺脏病理变化
  • 3.6 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况
  • 讨论
  • 1. 缺失株的体内遗传稳定性
  • 2. 基因缺失减毒株的毒力
  • 3. 缺失株诱导动物的免疫保护性
  • 3.1 攻毒菌株的选择
  • 3.2 APP血清型交叉保护
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢

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