登革病毒2型及其E蛋白与宿主细胞氧化还原状态的关系

论文摘要

登革病毒（dengue virus,DV）是黄病毒属的单股正链RNA病毒,分为四个血清型（DV14）。DV主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,每种血清型都可引起人类登革热（classical dengue fever, DF）和登革出血热/登革休克综合征（dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS）。近年来,随着旅游业的发展和地球温暖化,DF和DHF/DSS流行、暴发越来越频繁。DHF/DSS患者病死率高,发病机制不清。较多的临床研究显示肝细胞是DV的重要靶细胞之一,肝损害在DHF/DSS发病过程中占有重要地位:1)肝组织中可以检测到DV抗原,并能分离到具有感染性的病毒;2)DV还可以感染体外培养的HepG2,HuH-7,HA22T,Hep3B,PLC等人类肝癌细胞株,培养上清中也可检测到成熟的病毒颗粒;3)DHF/DSS病人常常出现肝肿大,尸检可见肝组织脂肪变性,枯否氏细胞肥大等。血清转氨酶水平升高,凝血酶含量下降,其幅度变化与肝损害程度及出血、休克的发生密切相关。据文献报道,DV可以直接感染肝细胞,引起肝脏损伤,换言之,肝脏可能是DV重要的靶器官之一。然而,在过去相当长的时间里,学者们对DV感染后凝血系统、血管内皮细胞及炎症因子变化做了较多的研究,与之相比,肝细胞损伤机制所受关注较少,如能发现病毒复制对肝细胞哪些方面产生了影响,找到宿主细胞参与病毒复制的关键分子,不仅对DV感染机制的阐明有重要意义,同时也为进一步研究抗病毒药物奠定重要的基础。生理情况下,活性氧（reactive oxygen species,ROS）在体内维持在有利无害的极低水平,参与多种生命过程。当机体受到不利条件时,ROS在体内增多并引起组织细胞氧化损伤的病理过程,则称为氧化应激（Oxidative Stress,OS）。新近研究表明细胞氧化还原状态（redox state）的平衡参与病毒复制和致病过程。病毒由于缺乏能量代谢系统和必要的酶类而不能独立生存,严格依赖于宿主细胞。进入细胞后利用细胞的合成代谢系统进行病毒大分子合成,因而扰乱了宿主细胞的自身代谢和生理功能,导致细胞的氧化还原平衡被打破。细胞通过产生还原型谷胱苷肽（reduced glutathione,GSH）,超氧化物歧化酶（SOD）,硫氧还蛋白,触酶等抗氧化分子,保持它的还原状态。其中含三个半胱氨酸的GSH在真核细胞抗氧化方面最为重要。多种病毒如人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）等体内外感染均可改变细胞内氧化还原状态,使其处于促氧化状态（pro-oxidant）,即OS。病毒可通过增加细胞内氧化剂含量,或抑制抗氧化剂合成来影响宿主细胞氧化平衡,表现为氧化水平升高,抗氧化能力下降。Peterhans等最先于1979年发现用RNA病毒感染宿主细胞后,吞噬细胞可以产生ROS。他们用仙台病毒（Sendai Virus,SV）感染小鼠的脾细胞,最先证实病毒感染能使细胞产生ROS。1987年他们又发现流感病毒和副粘病毒体外可激活单核细胞和多核白细胞产生ROS。HIV感染时,细胞质、外周血淋巴细胞和肺表皮细胞浸出液中的抗氧化剂水平降低,含高水平GSH的T淋巴细胞被选择性丢失。Hennet等人发现感染A型流感病毒的小鼠肺脏内抗氧化物质,如GSH和维生素C和E,都有很大程度的下降。这说明病毒感染与氧化应激密切相关。此外,陆续报道的还有1型单纯疱疹病毒（herpessimplex virus-1,HSV-1）、HCV等,这些病毒感染均可使细胞内的GSH下降。研究认为病毒感染过程中的氧化还原状态的改变是GSH消耗的结果,不同病毒感染不同细胞对GSH消耗程度、持续时间和诱导机制不尽相同。副流感病毒在引起上皮细胞病变时,GSH的水平急剧降低。而HIV感染人巨噬细胞时只有慢性感染建立后才可观察到明显的抗氧化水平的降低。病毒感染所致的细胞促氧化状态,可能是在病毒与宿主细胞相互作用过程中,触发了某些因子,最终引起细胞内氧化还原状态改变,进而诱导细胞凋亡或细胞过度增殖等病理过程。上述研究提示病毒感染可能参与宿主细胞的氧化应激过程。进一步对病理生理条件下GSH代谢的研究,将有助于人们对疾病发生机制的认识,同时为疾病的治疗提供新的思路。目前对于DV感染引起宿主细胞氧化还原状态改变的报道较少。最近,有学者报道感染DV的病人体内氧化还原状态发生改变。因此推测,与其他急性病毒感染相似,DV感染对肝脏的直接损害作用可能是通过影响肝细胞的氧化还原状态引起的。在DV的10个蛋白中,E蛋白是位于DV表面的结构蛋白,是病毒颗粒的主要包膜蛋白。E蛋白在毒粒侵染细胞过程中起重要作用,E蛋白上可能具有某些宿主细胞表面受体结合的配体。E蛋白作为病毒的吸附蛋白,在病毒进入细胞过程中发挥关键作用。那么,E蛋白对宿主细胞的氧化还原状态又有何影响?鉴于以上的研究背景,本研究拟通过检测登革病毒2型（DV2）感染和稳定表达E蛋白的人肝癌细胞株HepG2细胞内外GSH的变化,以及药物处理改变细胞内GSH水平后病毒滴度的变化,反映DV2感染引起的宿主细胞氧化还原状态的改变及其对病毒感染的影响,初步探讨DV2感染与细胞内氧化还原状态的关系。期望本研究结果为深入阐明DHF/DSS的发病机制、DV的致病机理和进一步设计新型靶向抗病毒药物提供理论依据。本研究主要结果与结论如下:1. DV2感染对HepG2细胞内外GSH水平的影响感染组加入DV2以MOI=10感染HepG2细胞,模拟感染组则加入56℃灭活30min的病毒液,同等条件置于37℃,以感染起始记为0时,在感染10min、20min、30min、40min、60min/1h、2h、6h、12h、24h、48h（后5个时相点吸附后1h,更换病毒维持液）时,分别用PBS充分洗涤细胞,胰蛋白酶消化,取出细胞。经过四次快速冻融,离心取上清用于GSH的测定。取相同数量的细胞经超声裂解用于测定细胞蛋白浓度。结果发现,病毒感染后10min、20min、30min、40min、60min/1h,HepG2细胞内GSH水平与模拟感染组比较,呈下降趋势,其中以30min下降最为明显,为16.82±0.86nmol/mg（n=5）,与模拟感染组23.14±1.41nmol/mg（n=5）和感染组的其他时相点比较均有显著差异（P<0.01）。病毒感染后2h、6h、12h、24h、48h,HepG2细胞内GSH水平与模拟感染组比较,仍呈下降趋势,其中以2h,24h时下降较为明显,分别为29.51±3.16nmol/mg（n=5）和17.75±3.32nmol/mg（n=5）,与相应时相点的模拟感染组35.45±3.55nmol/mg（n=5）和22.91±4.15nmol/mg（n=5）以及感染组的其它时相点比较,差异显著（P<0.05）,其后逐渐恢复,到48h时已与模拟感染组无显著差异（P>0.05）。感染后30min上清中的GSH含量为47.86±3.00nmol/ml（n=4）,较模拟感染组升高33.09%,且有显著差异（P<0.05）,而模拟感染组与病毒原液则无显著差异（P>0.05）。以上结果说明DV2感染能够使HepG2细胞内GSH水平下降,改变宿主细胞的氧化还原状态,且呈现阶段性变化,推测可能与病毒的复制过程有关。结合感染后同一时相点细胞外GSH水平的升高和文献报道,推测DV2感染后30min细胞内GSH水平的快速降低可能是由于DV2感染所致细胞膜通透性增加、GSH的外漏引起的。2. DV2 E蛋白对宿主细胞内外GSH水平的影响首先构建了稳定表达E蛋白的HepG2细胞株pRe-E/HepG2,并且通过PCR、酶切、核苷酸测序及间接免疫荧光法进行了鉴定和检测,确认了该细胞中E蛋白的表达。同时构建了稳定转染空质粒的细胞株pRe-E/HepG2作为对照。然后测定了pRe-E/HepG2细胞内外GSH的水平。结果:pRe-E/HepG2细胞内GSH水平与pRe/HepG2细胞对照组比较,呈下降趋势。pRe-E/HepG2细胞内GSH平均浓度为25.61±2.23nmol/mg（n=4）,pRe/HepG2细胞内的GSH平均浓度为33.38±1.07nmol/mg（n=4）,与pRe/HepG2细胞比较,pRe-E/HepG2细胞内GSH下降了24.3%（P<0.01）。取对数生长期pRe-E/HepG2和pRe/HepG2细胞的培养上清0.5ml测定GSH浓度,发现pRe-E/HepG2细胞上清中GSH含量平均值为36.72±1.40nmol/ml（n=4）,pRe/HepG2细胞上清中GSH含量平均为57.41±2.00nmol/ml（n=4）,前者相较后者明显降低,两者差异显著（P<0.05）,前者较后者平均下降了36.35%。以上结果表明,稳定表达E蛋白的pRe-E/HepG2细胞较稳定转染空质粒的pRe/HepG2细胞,细胞内外GSH浓度均下降显著,提示E蛋白在宿主细胞中的表达不仅可以改变细胞内的氧化还原状态,还可以使宿主细胞外的GSH水平降低,在DV2感染诱使的细胞氧化还原状态变化的过程中,E蛋白可能起重要作用。3. BSO及外源性GSH处理对DV2感染的影响依据MTT实验结果并参照文献,选择BSO的处理浓度为0.2mM和1mM,外源性GSH的处理浓度为10mM和20mM。在不感染病毒的情况下,培养上清中加入0.2mM、1mM BSO处理18h,可使细胞内GSH含量由空白对照组的24.53±2.59nmol/mg（n = 5）分别下降至14.29±1.48nmol/mg（n=5）、14.05±1.93nmol/mg（n=5）（P<0.05）,且两种浓度下降幅度无显著差异（P>0.05）,幅度平均为42.24%（n=5）。在DV2感染+BSO处理组,感染前18h分别用0.2mM、1mM BSO预处理HepG2细胞,然后用DV2以MOI=1感染HepG2细胞,并维持BSO浓度至感染24h,空白对照组不加药物处理。感染后24h收取病毒上清,噬斑试验测定病毒滴度（PFU/ml）。结果发现0.2mM与1mM BSO处理组病毒滴度较空白对照组分别上升了119.79%（n=5）和127.51%（n=5）,与空白对照组比较差别显著（P<0.05）,但两种浓度BSO处理组的病毒滴度上升幅度无显著差异（P>0.05）。在不感染病毒的情况下,培养上清中加入10mM、20mM GSH溶液与空白对照组相比,细胞内GSH含量均无显著差异（P>0.05）;在DV2感染+GSH处理组,从感染起始到感染24h维持上清内GSH浓度分别为10mM、20mM,空白对照组不加药物处理。感染后24h收取病毒上清,测定病毒滴度（PFU/ml）。结果发现较空白对照组而言,10mM与20mM GSH处理组病毒滴度分别下降40.24%（n=5）和56.62%（n=5）,两种浓度GSH处理组均与空白对照组差异显著（P<0.05）,且20mM GSH处理组病毒滴度下降更为明显（P<0.05）;以上结果说明不仅DV2可以引起细胞内的氧化还原状态改变,细胞内的氧化还原状态反过来也可以影响DV2的复制和增殖。以上结果为阐明DV的致病机理和进一步设计靶向抗病毒药物提供了初步的实验依据。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 登革病毒2 型及其E 蛋白与宿主细胞氧化还原状态的关系
• 前言
• 第一节 登革病毒2 型感染对细胞内外GSH 水平的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第二节 登革病毒2 型E 蛋白对细胞内外GSH 水平的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第三节 BSO 及GSH 处理对登革病毒2 型感染的影响
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述一 病毒感染与氧化应激关系的研究进展
• 参考文献
• 文献综述二 登革病毒非结构蛋白N548 研究进展
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表和撰写的文章