中药合剂清火败毒饮抑制巨噬细胞释放TNF-a和HMGB1的研究

论文摘要

目的:中药清火败毒饮方（Qing Huo Bai Du Yin,QHBDY）灌喂SD-大鼠的血清干预烧伤血清刺激的RAW264.7巨噬细胞,观察其对早期炎症介质肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和晚期炎症介质高迁移率族蛋白1（high mobility group boxchromosomal protein 1,HMGBl）在RAW264.7巨噬细胞中表达的变化情况,以求了解中药QHBDY是否能够抑制TNF-α和HMGB1的释放。方法:以RAW264.7巨噬细胞为研究对象,通过SD大鼠正常血清、正常血清+中药灌喂SD-大鼠血清混合物、正常血清+烧伤血清、烧伤血清+中药灌喂SD-大鼠血清混合物干预细胞,采用酶联免疫法检测各组上清液中TNF-α的表达量,免疫印迹技术了解细胞胞浆、胞核及细胞外HMGB1表达的变化情况。结果:正常血清+烧伤血清干预的RAW264.7巨噬细胞上清液中TNF-α的表达量明显升高,而烧伤血清+中药灌喂SD-大鼠血清混合物组明显低于烧伤组,两者之间有统计学意义（P＜0.05）,正常血清及正常血清+中药灌喂SD-大鼠血清混合物组上清液中TNF-α表达量极低,与前两者之间有统计学意义（P＜0.05）。免疫印迹技术观察发现:正常RAW264.7巨噬细胞胞浆、胞核中有少量HMGB1表达;正常血清及正常血清+中药灌喂SD-大鼠血清混合物干预后,HMGB1的表达量与正常RAW264.7巨噬细胞HMGB1表达量无统计学意义（P＞0.05）;烧伤血清干预的RAW264.7巨噬细胞,其细胞浆、细胞核中的HMGB1表达量增加,而烧伤血清+中药灌喂SD-大鼠血清混合物干预组,HMGB1在细胞浆、细胞核的表达量增加,但较烧伤血清干预组低,两组有统计学意义.在正常血清、正常血清+中药灌喂SD-大鼠血清混合物及正常培养基培养的RAW264.7胞外未检测出HMGB1,在正常血清+烧伤血清组和烧伤血清+中药灌喂SD-大鼠血清混合物组的培养基中18小时检测到HMGB1,烧伤组明显高于中药干预组,且呈时间依赖性,烧伤组与中药组有统计学意义（P＜0.05）。结论:烧伤血清能引起RAW264.7释放早期炎性介质TNF-α及晚期炎性介质HMGB1。中药血清能明显抑制烧伤血清所致的早期炎性介质TNF-α及晚期炎性介质HMGB1的释放。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 实验仪器及所用试剂
• 1.1 实验仪器
• 1.2 实验试剂及耗材
• 第二章 实验技术路线
• 第三章 实验材料与方法
• 3.1 实验对象
• 3.1.1 实验细胞株
• 3.1.2 实验动物
• 3.2 主要试剂的配制
• 3.3 细胞培养实验方法
• 3.3.1 冻存细胞复苏
• 3.3.2 细胞冻存
• 3.3.3 细胞传代培养
• 3.3.4 细胞计数
• 3.4 动物实验方法
• 3.4.1 SD大鼠背部脱毛
• 3.4.2 正常SD大鼠血清制备
• 3.4.3 烧伤SD大鼠模型制备
• 3.4.4 烧伤SD大鼠血清制备
• 3.4.5 中药灌喂SD大鼠血清制备
• 3.5 试验分组及HMGB1的检测
• 3.5.1 干预分组
• 3.5.2 蛋白样品制
• 3.5.3 Bradford法测定蛋白质浓度
• 3.6 Western blotting步骤
• 3.6.1 SDS-PAGE电泳
• 3.6.2 转膜
• 3.6.3 免疫反应
• 3.6.4 化学发光、显影、定影
• 3.6.5 Western blot条带的灰度扫描及其定量分析
• 3.7 实验分组及TNF-a的检测
• 3.7.1 干预分组
• 3.7.2 实验步骤
• 3.7.3 实验过程
• 3.8 结果统计及判定
• 第四章 实验结果
• 4.1 各实验组上清液中TNF-a情况
• 4.2 各实验组RAW264.7胞浆、胞核及胞外HMGB1的表达情况
• 第五章 讨论
• 5.1 各组干预RAW246.7巨噬细胞后上清液中TNF-α的表达情况
• 5.2 各实验组RAW246.7细胞浆、细胞核及细胞外HMGB1的表达情况
• 第六章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果