农杆菌介导IP-10基因遗传转化马铃薯的研究

论文摘要

本论文利用马铃薯微型薯为试验材料,通过不同激素组合试验,优化了东农303品种的高效再分化体系。采用农杆菌介导法将IP-10基因导入马铃薯基因组中,并通过PCR、RT-PCR、GFP蛋白荧光检测,验证了目的基因已转入马铃薯基因组中。另外,探讨了转基因植株试管薯形成的最佳条件。1.利用马铃薯脱毒试管苗茎段、叶片和薯块为试验材料,通过IAA、NAA、GA3、IBA、6-BA、ZT的不同组合,进行了再分化试验。结果表明,诱导茎段愈伤的最适培养基为:MS+IBA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L,愈伤诱导率为86%;但其出芽率较低;诱导叶片再分化的最适培养基为:MS+ZT 10.0mg/L+NAA 0.1mg/L+GA3 0.2mg/L,出芽率达150%;薯块再分化最适培养基为:MS+IAA 1.0mg/L+ZT 3.5mg/L,分化率为120%。2.对农杆菌侵染并通过潮霉素筛选的转基因植株,进行了IP-10基因和潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）的PCR扩增,分别获得了276bp和602bp所需目的条带。通过进一步的RT-PCR反应和GFP荧光蛋白的激光共聚焦检测,最终获得3个转基因株系。3.探讨了KT、B9、CCC等激素和蔗糖浓度对转基因株系形成试管薯的影响。结果表明,当KT浓度为100mg/L,B9的浓度为150mg/L,蔗糖的浓度为8%时试管薯形成量较多,其MT/Plantlet分别为1.4,1.5和1.6,表明KT、B9和蔗糖均为转基因试管薯诱导的可选试剂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 植物生物反应器
• 1.2.1 植物生物反应器的特点
• 1.2.2 植物药物生物反应器的应用
• 1.2.3 转基因植物表达药物蛋白概况
• 1.3 马铃薯转基因方法
• 1.3.1 根癌农杆菌转化
• 1.3.2 发根农杆菌转化
• 1.3.3 花粉管通道法
• 1.3.4 基因枪法
• 1.4 IP-10蛋白概述
• 1.5 试验意义
• 2 马铃薯东农303品种遗传转化体系优化
• 2.1 试验材料、试剂与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 质粒和菌株
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 马铃薯茎段再分化
• 2.2.2 马铃薯叶片再分化
• 2.2.3 薯块再分化
• 2.2.4 生根诱导培养基的筛选
• 2.2.5 农杆菌扩增
• 2.2.6 外植体的预培养
• 2.2.7 外植体侵染、共培养与脱菌
• 2.2.8 再分化过程中潮霉素选择压力的确定
• 2.2.9 生根过程中潮霉素选择压力的确定
• 2.2.10 菌种保存
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 马铃薯茎段再分化
• 2.3.2 马铃薯叶片再分化
• 2.3.3 马铃薯微型薯再分化
• 2.3.4 生根培养基的筛选
• 2.3.5 再分化过程中潮霉素的选择压力
• 2.3.6 生根过程中潮霉素的选择压力
• 2.4 本章小结
• 2.4.1 结论
• 2.4.2 讨论
• 3 转化植株的检测
• 3.1 材料、试剂及仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.1.4 引物
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 植物总DNA的提取（CTAB法）
• 3.2.2 质粒DNA提取（碱裂解法）
• 3.2.3 目的基因的PCR检测
• 3.2.4 潮霉素磷酸转移酶基因的PCR检测
• 3.2.5 目的基因的RT-PCR检测
• 3.2.6 转化植株的GFP蛋白检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 待检测植株的DNA提取
• 3.3.2 质粒提取
• 3.3.3 PCR扩增
• 3.3.4 RT-PCR扩增
• 3.3.5 转化植株的GFP蛋白检测
• 3.4 本章小结
• 3.4.1 结论
• 3.4.2 讨论
• 4 转基因植株的试管薯形成条件的探讨
• 4.1 材料、试剂与仪器
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试剂
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 不同蔗糖浓度对试管薯形成的影响
• 4.2.2 不同KT浓度对试管薯形成的影响
• 4.2.3 不同CCC浓度对试管薯形成的影响
• 4.2.4 不同B9浓度对试管薯形成的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 不同蔗糖浓度对试管薯形成的影响
• 4.3.2 不同KT浓度对试管薯形成的影响
• 4.3.3 不同CCC浓度对试管薯形成的影响
• 4.3.4 不同B9浓度对试管薯形成的影响
• 4.4 本章小结
• 4.4.1 结论
• 4.4.2 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢