苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究

论文题目: 苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

导师: 杨之为,谢炳炎

关键词: 苏云金芽孢杆菌,松材线虫,根结线虫,基因克隆

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 农业有害生物每年都对农作物的生产造成严重的损失,尤其是鳞翅目、鞘翅目、双翅目等害虫及植物病原真菌、寄生线虫等的危害最为严重。苏云金杆菌制剂是目前应用最为成功的一类微生物杀虫剂,在防治植物病害方面也取得了一定的进展。深入挖掘我国丰富的苏云金芽孢杆菌资源,分离克隆新型高毒力的杀虫蛋白基因,对构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物具有重要的理论意义和应用价值。本研究从我国20 省市自治区共采集178 份土样,采用常规稀释平板法,并结合伴孢晶体的复红染色鉴定苏云金杆菌,共分离获得苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)51株。对51 株Bt 分离菌株的cry 基因进行了PCR 鉴定。以cry1,cry2,cry3,cry4,cry-n,cry7,cry8,cry11,cry13 和cyt 的通用引物作PCR 分析,研究结果表明:4 株含有cry4,12 株含有cry7,4 株含有cry8,4 株含有cry1,2 株同时含有cry1 和cry2,27 株无PCR产物,未检测到其它基因型。对4 株含有cry4 菌株进行了系统研究。结果表明:编号为BD-2-1,BD-2-2,HC-7-1和STG-21-7 的Bt 菌株主要形成球形伴孢晶体,部分为不规则形;前3 个菌株的11 项生理生化指标基本一致,但与STG-21-7 差别较大;这4 个菌株活性晶体蛋白主要由66~72kDa、27~31kDa 和20kDa 组成;从cry4 基因序列同源性分析认为,BD-2-1 和BD-2-2 为同一菌株,与另外2 株有差异,但4 菌株所含基因的同源性大于90%,都与cry40-like 同源性为88%。对4 株含有cry8 菌株进行了系统研究。编号为YN-1-1、SH-1-2、HZJ-35-17 和HZJ-3-3 的菌株主要形成扁长方形伴孢晶体,部分为不规则形;11 项生理生化指标差别较大;HZJ-35-17 的杀虫晶体蛋白主要为130kDa 和70~75kDa,其它菌株的杀虫晶体蛋白主要为70~75 kDa;从cry8 基因序列同源性分析认为,YN-1-1、SH-1-2、HZJ-35-17和HZ-3-3 的同源性大于90%; YN-1-1 与SH-1-2 所含cry8 基因的同源性高达99.67%;HZJ-3-3 所含cry8 基因和cry8Bb1 基因同源性达97%;HZJ-35-17 和YN-1-1 及SH-1-2的同源性为95%,这4 株所含基因与cry8B的基因同源性为89%,和cry8A 基因的同源性为83%。　　用51 个苏云金杆菌菌株对松材线虫进行了活性测定,筛选到2 株活性较高的苏云金杆菌,(其编号分别为XZ-4-5 和HC-7-1)分别提取外毒素和内毒素对松材线虫生测,明确了活性物质主要是外毒素,内毒素活性不如外毒素高。通过温室盆栽试验,结果表明,2 个菌株对番茄根结线虫(Meloidogyne spp)均有一定的防效。菌株XZ-4-5 的外毒素对松材线虫有一定的活性,且含有对鞘翅目害虫有活性的cry7 基因,这对进一步研究其对松材线虫或其传播介体松褐天牛的杀虫活性具有重要

论文目录:

缩略词

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英文摘要

目录

第一章 文献综述

1.1 苏云金芽孢杆菌杀虫基因研究进展

1.1.1 苏云金芽孢杆菌简介

1.1.2 苏云金芽孢杆菌的分离方法研究进展

1.1.3 苏云金杆菌的伴孢晶体与毒力的关系

1.1.4 苏云金芽孢杆菌的分类

1.1.5 苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因的研究

1.1.5.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的分类及杀虫谱

1.1.5.2 苏云金杆菌基因型的鉴定

1.1.5.3 苏云金芽孢杆菌cry/cyt 基因的定位

1.1.5.4 苏云金芽孢杆菌cry/cyt 基因的克隆

1.1.6 苏云金芽孢杆菌晶体蛋白杀虫机理研究

1.1.7 苏云金芽孢杆菌cry/cyt 基因的开发和应用

1.1.7.1 Bt 转基因工程菌

1.1.7.2 Bt 转基因植物研究进展

1.1.7.2.1 Bt 转基因植物取得的成果

1.1.7.2.2 我国Bt转基因植物的现状

1.1.7.2.3 Bt 转基因植物存在的问题

1.2 苏云金芽孢杆菌对植物寄生线虫的作用

1.2.1 植物寄生线虫的主要类群及危害

1.2.2 植物寄生线虫的防治

1.2.2.1 植物寄生线虫的化学防治及弊端

1.2.2.2 植物寄生线虫的生物防治

1.2.2.2.1 防治植物寄生线虫的真菌种类

1.2.2.2.2 植物寄生线虫的细菌种类

1.2.3 苏云金芽孢杆菌对植物寄生线虫的作用

1.2.3.1 苏云金芽孢杆菌杀线虫活性的发现

1.2.3.2 杀线虫苏云金杆菌(Bt)的基因型

1.2.3.3 苏云金杆菌杀线虫的基因及其编码的毒蛋白

1.2.3.4 苏云金芽孢杆菌杀线虫机理

1.3 抗线虫基因及基因工程研究进展

1.3.1 应用蛋白酶抑制剂防治植物寄生线虫的策略

1.3.2 应用植物中抗线虫基因防治植物寄生线虫的策略

1.3.3 应用启动子转基因防治植物寄生线虫的策略

1.3.4 应用 Bt 毒蛋白防治植物寄生线虫的策略

1.4 本研究的目的和意义

1.4.1 研究目的及意义

1.4.2 研究内容

第二章 苏云金芽孢杆菌的分离及基因鉴定

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.1.1 土样的采集

2.1.1.2 培养基

2.1.1.3 试剂

2.1.1.4 仪器设备

2.1.2 研究方法

2.1.2.1 苏云金芽孢杆菌的分离

2.1.2.2 苏云金杆菌DNA 的提取

2.1.2.3 PCR 鉴定苏云金杆菌cry/cyt 基因

2.2 结果与分析

2.2.1 苏云金杆菌的分离结果

2.2.2 苏云金芽孢杆菌cry/cyt 基因的鉴定

2.3 小结与讨论

第三章 含cry4基因的苏云金芽孢杆菌的生物学特性及基因序列分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 培养基和试剂

3.1.3 仪器设备

3.1.4 研究方法

3.1.4.1 苏云金杆菌菌体形态及蛋白晶体观察

3.1.4.2 苏云金杆菌生理生化反应

3.1.4.3 苏云金杆菌菌株晶体蛋白SDS-PAGE电泳分析

3.1.4.4 苏云金杆菌cry4 基因序列分析

3.2 结果与分析

3.2.1 营养体及伴孢晶体形态观察

3.2.2 生理生化反应

3.2.3 杀虫晶体蛋白分析

3.2.4 苏云金杆菌cry4 基因序列

3.3 小结与讨论

第四章 含有cry8基因的苏云金杆菌的生物学特性及基因序列分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.2.1 营养体及伴孢晶体形态观察

4.2.2 生理生化反应

4.2.3 杀虫晶体蛋白分析

4.2.4 苏云金杆菌cry8 基因序列

4.3 小结与讨论

第五章 苏云金杆菌杀线虫活性测定

5.1 材料与方法

5.1.1 供试菌种

5.1.2 供试培养基

5.1.3 供试线虫及培养

5.1.4 研究方法

5.1.4.1 发酵液的制备

5.1.4.2 毒蛋白的制备

5.1.4.3 外毒素的制备

5.1.5 线虫的生测方法

5.1.6 毒力方程的计算及 LC_49

5.1.7 活性菌株温室防治根结线虫试验

5.2 结果与分析

5.2.1 对植物线虫有活性苏云金杆菌的筛选

5.2.2 内毒素对松材线虫的活性测定

5.2.3 外毒素对松材线虫的活性测定

5.2.4 温室盆栽试验结果

5.3 小结与讨论

第六章 苏云金杆菌XZ-4-5生物学特性及cry7基因的克隆及序列测定

6.1 材料和方法

6.1.1 供试材料

6.1.2 试剂

6.1.3 引物的设计与合成

6.1.3.1 特异引物的设计

6.1.3.2 扩增全长基因引物的设计

6.1.3.2 引物的合成

6.1.4 研究方法

6.1.4.1 苏云金杆菌XZ-4-5 菌体形态及蛋白晶体观察

6.1.4.2 苏云金杆菌XZ-4-5 生理生化反应

6.1.4.3 苏云金杆菌XZ-4-5 晶体蛋白SDS-PAGE电泳分析

6.1.4.4 苏云金杆菌XZ-4-5 cry7 基因的克隆

6.1.4.5 克隆片段的序列分析

6.1.4.6 基因定位的研究

6.2 结果与分析

6.2.1 菌体形态及蛋白晶体观察

6.2.2 生理生化反应

6.2.3 杀虫晶体蛋白分析

6.2.4 杀虫晶体蛋白基因cry7 的克隆研究

6.2.4.1 全长基因的克隆研究

6.2.4.2 cry7 基因部分片段的克隆研究

6.2.4.3 cry7 基因部分片段的序列及生物学信息分析

6.2.5 杀虫晶体蛋白基因cry7 的定位研究

6.3 讨论

第七章 主要的结论及进一步的设想

7.1 主要结论

7.2 进一步设想

参考文献

附录

附图

致谢

作者简历

发布时间: 2005-12-22

参考文献

• [1].苏云金芽孢杆菌vip3A基因及杀虫防病工程菌研究[D]. 吴燕榕.福建农林大学2004
• [2].苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究[D]. 宋福平.中国农业科学院2003
• [3].苏云金芽孢杆菌WB9的研究[D]. 黄志鹏.福建农林大学2005
• [4].苏云金芽孢杆菌的肠毒素及其安全性研究[D]. 黄必旺.福建农林大学2005
• [5].苏云金芽孢杆菌的重要功能基因[D]. 黄天培.福建农林大学2006
• [6].苏云金芽孢杆菌LLP29菌株的分离及其对白纹伊蚊作用机理的研究[D]. 张灵玲.福建农林大学2007
• [7].苏云金芽孢杆菌新助剂筛选及发酵因子优化[D]. 黄勤清.福建农林大学2006
• [8].苏云金芽孢杆菌cry8Ca2基因的活性分析及在转基因烟草中的表达[D]. 郎志宏.中国农业科学院2005
• [9].苏云金芽孢杆菌FS140菌株蛋白酶的研究[D]. 郑毅.福建农林大学2008
• [10].高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究[D]. 姚江.中国农业科学院2002

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• [3].苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究[D]. 宋福平.中国农业科学院2003
• [4].高效广谱苏云金芽孢杆菌工程菌的构建及杀虫晶体蛋白的研究[D]. 王广君.中国农业科学院2005
• [5].苏云金芽孢杆菌WB9的研究[D]. 黄志鹏.福建农林大学2005
• [6].苏云金芽孢杆菌的肠毒素及其安全性研究[D]. 黄必旺.福建农林大学2005
• [7].GFP在南方根结线虫（Meloidogyne incogita）拮抗菌Alcaligenes faecalis研究中的应用[D]. 周莉娟.福建农林大学2005
• [8].根结线虫寄生真菌资源与淡紫拟青霉PL89的研究[D]. 肖顺.福建农林大学2006
• [9].苏云金芽孢杆菌的重要功能基因[D]. 黄天培.福建农林大学2006
• [10].苏云金芽胞杆菌杀线虫菌株的筛选及其活性因子研究[D]. 余洁.福建农林大学2008

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