棉花航天诱变芽黄突变体SSH文库的构建及差异表达基因分析

论文摘要

棉花芽黄突变体在自然界中广泛存在,从1925年第一次发现至今,已经鉴定出了22个芽黄突变体,涉及26个芽黄突变基因。本实验室从棉花早熟品种中棉所58的航天诱变后代中发现了一新的芽黄突变体,其黄化现象从第一片真叶长出后开始,至盛花期结束。具体性状表现为:子叶绿色,真叶刚长出时为黄色,3天时（倒2位叶片）黄化最严重,10天后（倒5位叶片）变绿,如此循环,直至盛花期结束,且果枝上的幼嫩叶片也是黄色的。以往对芽黄突变体的研究大多停留在遗传规律上,对于其产生的分子机制仍不清楚。本实验通过构建突变体倒2叶/突变体倒5叶正反消减文库、突变体倒2叶/野生型倒2叶正反消减文库,筛选芽黄突变体中的差异表达基因,以期从分子水平上了解芽黄突变体产生的原因。本研究取得的主要结果如下:1.利用快速叶绿素荧光诱导动力学测定和JIP-test数据分析方法,研究了晴天条件下野生型和突变体不同叶位叶片（倒1叶、倒2叶、倒3叶、倒4叶、倒5叶）的原初光化学反应的变化。野生型植株的叶片从倒1叶至倒5叶其Fv/Fm和PIABS值呈递增的变化趋势,而突变体植株的倒2位叶片的Fv/Fm和PIABS值最低,之后逐渐增加,至倒5叶时与野生型的相比无显著性差异。野生型植株不同叶位叶片的Wk值呈递减的变化趋势,突变体植株的幼嫩叶片（倒1叶和倒2叶）Wk值较高,之后下降,表明突变体幼嫩叶片放氧复合体受到损害。通过对参数MO、Sm、φEo、ψO的分析发现,突变体叶片发育早期PSⅡ受体侧的QA-大量积累,电子传递链受阻。而参数ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC、DIo/RC等的变化则表明突变体单位反应中心吸收的较多的能量以热和荧光的形式被耗散掉。2.成功构建了4个消减文库,共挑选了4032个单克隆,去冗余拼接后得到2459条Unigenes。通过Blastn和Blastx后,部分序列涉及叶绿素合成、叶绿体发育、光合机构建成等代谢途径。从中挑选了14个相关基因进行qRT-PCR验证,与野生型相比,突变体黄化叶片中PEP转录的质体编码的光合相关基因（PetB、PsbH、psbC和psbD等）表达量降低,NEP转录的编码转录/翻译的器官的基因（rpoA和rpoB）表达量升高,表明突变体黄化叶片中质体转录物的翻译效率低或者质体蛋白易降解。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 叶绿素缺失突变体研究现状
• 1.2 叶绿素缺失突变体的分子机制
• 1.2.1 叶绿素合成受阻
• 1.2.2 叶绿体光合蛋白合成或输入受阻
• 1.2.3 叶绿体RNA 转录物未被编辑
• 1.2.4 过量光损伤
• 1.2.5 四吡咯循环各物质之间的相互抑制
• 1.3 棉花芽黄突变体研究现状
• 1.3.1 棉花芽黄突变体的遗传鉴定
• 1.3.2 棉花芽黄突变体与杂种优势利用
• 1.4 抑制性消减杂交技术（SSH）的原理及应用
• 1.4.1 抑制性消减杂交技术主要技术流程
• 1.4.2 抑制性消减杂交技术的应用
• 1.5 研究目的和意义
• 1.6 技术路线
• 第二章 芽黄突变体叶绿素荧光动力学特性研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 芽黄突变体vsp 的光合色素含量
• 2.2.2 芽黄突变体快速叶绿素荧光诱导动力学曲线
• 2.2.3 芽黄突变体不同叶位叶片PSⅡ的变化
• 2.3 讨论
• 第三章 芽黄突变体不同叶位叶片抑制性消减文库构建
• 3.1 试验材料与试剂
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验试剂及试验设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 不同材料总RNA 提取
• 3.2.2 消减文库的构建
• 3.2.3 消减文库单克隆的测序及生物信息学分析
• 3.2.4 qRT-PCR 验证
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 芽黄突变体不同叶位叶片性状表现
• 3.3.2 总RNA 的提取
• 3.3.3 双链cDNA 合成最优循环数确定
• 3.3.4 RsaⅠ酶切
• 3.3.5 接头连接效率分析
• 3.3.6 二次PCR 产物分析
• 3.3.7 消减效率检测分析
• 3.3.8 消减文库插入片段检测
• 3.4 生物信息学分析
• 3.4.1 差异表达EST 测序结果分析
• 3.4.2 COG 分析
• 3.4.3 差异表达基因的qRT-PCR 分析
• 3.5 讨论
• 3.5.1 消减文库的构建
• 3.5.2 消减文库质量的检测
• 3.5.3 4 个消减文库中序列的比较
• 3.5.4 差异表达基因功能分析
• 第四章 全文结论
• 4.1 测量了突变体不同叶位叶片的叶绿素荧光参数
• 4.2 构建了对照和突变体的发育正常的叶片与黄化叶片之间的抑制性消减文库
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历