河南低致病性禽流感病毒（H9亚型）分离鉴定及生物学特性研究

论文摘要

禽流感是一种由A型流感病毒（Avian Influenza,AIV）引起的以禽类感染为主的传染性疾病,根据其致病性的不同可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。低致病性禽流感引发呼吸道症状及产蛋率下降,其中H9亚型禽流感病毒是影响我国养禽业的主要低致病性病毒亚型。近年来河南多家鸡场在进行H9亚型禽流感病毒免疫后,疑似病例仍不断发生,给养鸡业造成了一定的经济损失,给鸡群的防疫安排带来了相当的困难。本研究从河南郑州、南阳、焦作等不同地区采集180份疑似病料,通过接种9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔,收集尿囊液,进行血凝试验、血凝抑制试验初步筛选到10份H9亚型禽流感病毒。根据流感病毒命名的标准体系分别命名为A/chicken/Luohe/01/2009（H9 Subtype）、A/chicken/Luohe/02/2010（H9 Subtype）、A/chicken/Xinxiang/04/2009（H9 Subtype）、A/chicken/Xingyang/18/2009（H9 Subtype）、A/chicken/Xinzheng/22/2009（H9 Subtype）、A/duck/Luohe/37/2009（H9 Subtype）、A/chicken/Kaifeng/44/2009（H9 Subtype）、A/chicken/Zhengzhou/45/2009（H9 Subtype）、A/chicken/ Zhengzhou /131/2010（H9 Subtype）、A/chicken/Xinxiang/132/2010（H9 Subtype）,分别简称为LH01、LH02、XX04、XY18、XZ22、LH37、KF44、ZZ45、ZZ131、XX132。对其中4株H9亚型禽流感病毒进行理化特性、血凝特性、EID50、MDT、ICPI试验等生物特性研究。所得LH01、XZ22、ZZ131和XX132 4个分离株生物学特性符合禽流感病的基本特性,其EID50结果分别为10-8.68、10-8.5、10-9.5、10-7.83 EID50/0.1ml; MDT值分别为85.6 h、107.2 h、117.6 h、110h;ICPI值分别为17/80=0.2125、13/80=0.1625、14/80=0.175、11/80=0.1375。为了解这4株H9亚型禽流感病毒分离株的分子流行特性,在全基因组序列测定的基础上,比较分析了核苷酸及推导氨基酸全序列之间及与GenBank中登陆的H9亚型代表毒株基因序列之间的同源性,并分析HA及NA的推导氨基酸蛋白裂解位点、受体结合位点及潜在的糖基化位点和红细胞吸附位点等的变异状况及其系统进化地位。这四个毒株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的开放阅读框分别由2280、2274、2151、1683、1497、1401、759、864个碱基组成,分别编码759、757、716、560、498、466、252/97、217/121氨基酸残基。这4株病毒HA上的裂解位点序列均为RSSR↓GLF,具有典型的低致病性禽流感病毒的特征,NA茎部均缺失62、63、64位的I、T、E3个氨基酸残基。同源性分析显示XZ22和XX132这两个毒株的8个基因的同源性都最高,都在99%以上,基本处于同一进化分支上;这四个分离株与1997-2009年间大部分中国大陆分离株亲缘关系很近,而且NA、NP和三个聚合酶基因与部分不同亚型病毒间同源性也不低。系统进化关系显示这4个分离毒株的两个表面蛋白基因HA、NA和非结构基因NS均属于类Y280群;而两个内部基因NP、M和聚合酶PA基因可以分为两个群,LH01属于类Y280群,而XZ22、ZZ131和XX132均属于类G1群;余下两个聚合酶基因PB1和PB2也大致分为两个群,LH01和ZZ131属于类Y280群,XZ22和XX132属于类G1群。这些结果为河南H9亚型禽流感病毒的分子流行情况、鉴别诊断及防治提供技术依据。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 1 禽流感概述
• 2 H9 亚型禽流感的流行情况
• 2.1 国内流行情况
• 2.2 国外流行情况
• 3 禽流感病原学研究进展
• 3.1 禽流感病毒分类地位及形态特征
• 3.2 禽流感病毒理化特性及培养特性
• 3.3 禽流感病毒宿主特异性和致病性
• 3.4 禽流感病毒的感染复制机制
• 4 禽流感病毒分子生物学研究
• 4.1 禽流感病毒基因组结构特征及转录复制过程
• 4.2 禽流感病毒基因组及编码蛋白的结构和功能
• 4.2.1 HA 基因
• 4.2.2 NA 基因
• 4.2.3 NP 基因
• 4.2.4 聚合酶基因
• 4.2.5 M 基因
• 4.2.6 NS 基因
• 4.3 禽流感病毒的遗传变异
• 4.3.1 抗原性变异
• 4.3.1.1 抗原漂移
• 4.3.1.2 抗原转变
• 4.3.2 致病性变异
• 引言
• 试验一 H9 亚型禽流感病毒的分离与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器设备
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 试验动物
• 1.1.4 病料来源
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 病料样品的处理
• 1.2.2 病毒的分离培养及纯化
• 1.2.3 血凝试验（HA）及血凝抑制试验（HI）
• 1.2.4 中和试验
• 1.2.5 RT-PCR 检测
• 1.2.5.1 RNA 的提取步骤如下
• 1.2.5.2 cDNA 的合成
• 1.2.5.3 RT-PCR 扩增
• 1.2.5.4 1 %琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.5 鸡胚半数感染量（EID50）的测定
• 1.2.6 理化试验
• 1.2.6.1 乙醚敏感试验
• 1.2.6.2 氯仿敏感性试验
• 1.2.6.3 耐酸性试验
• 1.2.7 最小致死剂量致鸡胚死亡的平均时间（MDT）的测定
• 1.2.8 1 日龄鸡脑内致病指数（ICPI） 测定
• 2 结果与分析
• 2.1 病毒的分离结果
• 2.2 LH01 等 4 个分离株 RT-PCR 结果
• 2.3 LH01 等 4 个分离株鸡胚半数感染量（EID50）的测定结果
• 2.4 LH01 等 4 个分离株理化试验结果
• 2.5 LH01 等 4 个分离株最小致死剂量致鸡胚死亡的平均时间（MDT）测定结果
• 2.6 LH01 等 4 个分离株对 1 日龄鸡脑内致病指数（ICPI） 测定结果
• 3 结论与讨论
• 试验二 H9 亚型禽流感病毒河南分离株全基因组的克隆 与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 毒株
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂及试剂盒
• 1.1.4 质粒与菌种
• 1.1.5 试剂的配制
• 1.1.5.1 琼脂糖电泳试剂
• 1.1.5.2 大肠杆菌转化用溶液
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 病毒RNA 的提取
• 1.2.2 全基因的RT-PCR扩增
• 1.2.2.1 cDNA 第一链合成
• 1.2.2.2 PCR扩增
• 1.2.3 1 %琼脂糖凝胶电泳
• 1.2.4 4 株河南分离毒株全基因克隆及鉴定
• 1.2.4.1 RT-PCR 产物的纯化
• 1.2.4.2 PCR产物的连接
• 1.2.4.3 连接产物的转化
• 1.2.4.4 重组克隆的筛选
• 1.2.4.5 重组质粒的提取
• 1.2.4.6 重组质粒的酶切鉴定
• 1.2.5 4 株 H9 亚型禽流感病毒全基因组核苷酸序列测定及序列分析
• 1.2.6 4 株H9 亚型禽流感病毒全基因系统进化树分析
• 2 结果与分析
• 2.1 4 株河南分离毒株8 个基因片段的RT-PCR 扩增结果
• 2.2 4株河南分离毒株8个基因片段PCR产物纯化结果
• 2.3 重组质粒的酶切鉴定及测序鉴定
• 2.4 全基因组的测序及序列分析
• 2.4.1 HA 基因分析
• 2.4.2 NA 基因分析
• 2.4.3 PB2 基因分析
• 2.4.4 PB1 基因分析
• 2.4.5 PA 基因分析
• 2.5 系统进化树分析
• 3 结论与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• Abstract
• 附录