OPN反义寡核苷酸对微缺氧下人结肠癌细胞HT-29体外侵袭转移潜能的影响

论文摘要

术后肝转移是影响大肠癌原发灶根治性切除术后5年生存率的主要原因,如能在术前或术中用一简便易行的指标筛选出肝转移的高危病例,采取积极措施加以干预和控制,这对提高结直肠癌患者的生存率具有重要意义。局部浸润和远处转移是恶性肿瘤最重要的生物学特性,在实体肿瘤的恶性演进中,细胞外间质的微环境起着重要的调控作用。缺氧乃实体肿瘤物理微环境的基本特征。适度缺氧可能是肿瘤细胞发生遗传不稳定,恶性转化甚至转移的始动因素。骨桥蛋白（osteopontin,OPN）是一种与肿瘤侵袭转移密切相关的磷酸化糖蛋白,在缺氧下特异性地表达上调。但OPN缺乏缺氧反应元件（hypoxia response elements,HRE）,并不受HIF-1α的调控。因此,我们推测OPN可能是继HIF-1α之外,缺氧下肿瘤生物学行为的重要调控点。结直肠癌作为消化系统常见的实体肿瘤,其发展演进同样也在缺氧的微环境中进行。但就缺氧下结肠癌细胞的生物学行为而言,尚缺乏较为完整的研究。模拟体内的缺氧环境,深入探讨OPN与肿瘤侵袭转移的关系更未见报道。我们将肿瘤侵袭转移的分子标记物OPN结合原发癌灶侵袭前沿的形态学特征,探讨其与大肠癌肝转移的关系。将人结肠癌细胞HT-29作为研究对象,参照体内肿瘤组织氧分压水平,建立离体缺氧模型,观察缺氧下细胞的生物学行为,探讨OPN与微缺氧诱导的肿瘤恶性转化的关系。第一部分OPN在大肠癌原发癌灶侵袭边缘的表达与肝转移的关系目的:本研究旨在探讨瘤芽在不同大肠癌病例的分布特征以及OPN等在原发癌灶和瘤芽的表达,以评价其可否作为Dukes C期大肠癌术后肝转移的相关因素。方法:将Dukes C期以上病例分成3组:A组为同时性肝转移组,B组为异时性肝转移组,C组为无肝转移组。HE染色后,重点观察位于大肠癌侵袭前沿的瘤芽分布特征,并准确计数。应用免疫组化法分别检测OPN、NF-κB在原发癌灶和瘤芽的表达。结果:瘤芽位于肿瘤侵袭前沿,是失去极性的去分化癌细胞,呈孤立或不规则小梁状分布。瘤芽BD（+）和OPN在大肠癌原发癌灶的强阳性表达在同时性肝转移组与无肝转移组间的差异具有显著性（p<0.01）。OPN在瘤芽的阳性表达在同时性肝转移组和无肝转移组以及在异时性肝转移组和无肝转移组的差异均具有显著性（p<0.01）。各组间NF-κB在原发癌灶、瘤芽的表达无显著差别。结论:瘤芽BD（+）、OPN在原发癌灶的强阳性表达均提示大肠癌发生肝转移的可能性较大。如将瘤芽分布特征结合OPN的表达,则可提高预判的准确性,可以考虑作为Dukes C期大肠癌术后肝转移的相关因素。第二部分离体缺氧模型的制备和鉴定以及缺氧对人结肠癌细胞HT-29生长活力的影响目的:模拟体内肿瘤不同程度的缺氧环境,建立简单、稳定可靠的离体缺氧模型,比较各梯度缺氧对HT-29细胞生长活力及细胞周期分布的影响,以筛选出最适HT-29细胞生长的微缺氧环境。方法:（1）自制缺氧检测装置,灌注不同氧浓度的混合气体,溶解氧测定仪实时动态监测培养液氧分压的变化。（2）RT-PCR检测低培养液氧分压下HT-29细胞HIF-1αmRNA的表达,以检验细胞是否处于缺氧状态。（3）倒置相差显微镜下观察缺氧各梯度组HT-29细胞的形态变化。（4）MTT检测各梯度缺氧对HT-29细胞增殖的影响,描绘细胞生长曲线。（5）流式细胞仪测定细胞周期分布、细胞凋亡比例并计算细胞增殖指数（PI）。结果:（ 1 ）输入7.8%、4.8%、2.4%和1.2%O2后20min , 10%FBS/RPMI-1640培养液的PO2分别恒定于30mmHg、20mmHg、10mmHg和5mmHg。（2）缺氧各梯度组HIF-1αmRNA的表达均较对照组明显上调,尤以PO220mmHg组为著。（3）缺氧培养24h后,PO230mmHg、PO220mmHg、PO210mmHg梯度组HT-29细胞的形态与对照组相似,而PO25mmHg梯度组则出现损伤性形态改变。（4）PO220mmHg梯度组HT-29细胞的（A570）值明显高于对照组,与对照组的差异具有统计学意义（p<0.05）。PO230mmHg、PO210mmHg梯度组的(A570)值也高于对照组,但差异不具有统计学意义（p>0.05）。各组中,以PO25mmHg梯度组的(A570)值最低。（4）PO220mmHg梯度组HT-29细胞G2/M期比例仍与对照组相似,S期则显著增加（P<0.05）, PO25mmHg梯度组则出现细胞周期G0/G1阻滞,S期细胞明显减少,凋亡细胞比例明显高于其它各组。PO230mmHg、PO210mmHg梯度组的细胞周期分布虽与对照组有所不同,但差异不具有统计学意义。结论:（1）本实验成功构建离体缺氧模型。（2）在适度缺氧下,由于缺氧的应激作用,可能使相关缺氧反应基因表达上调,抑制凋亡,诱导细胞增殖加快,通过刺激增殖和细胞保护而使肿瘤细胞在缺氧环境中长期生存。而严重缺氧导致细胞周期G1/S阻滞,细胞凋亡比例增加,增殖受到抑制,细胞形态出现损伤性改变。（3）在对照组和缺氧的4个梯度组中,PO220mmHg组处于缺氧的应激和损伤作用的平衡点,其生长活力最好。肿瘤瘤体内PO220mmHg位于瘤体边缘,提示:位于瘤体边缘的肿瘤细胞在缺氧的诱导下增殖活性更强。这为后续深入探讨该缺氧水平下肿瘤细胞的侵袭能力及其机制奠定了基础。第三部分微缺氧对人结肠癌细胞HT-29OPN和NF-κB表达及其侵袭能力的影响目的:观察HT-29细胞在微缺氧下的侵袭能力,检测OPN、NF-κB/p65的表达和MMP-2/9的活性变化,以探讨其向恶性表型转化的潜在机制。方法:（1）参照体内肿瘤瘤体边缘的氧分压（PO220mmHg）,建立微缺氧模型。（2）MTT比色试验测定HT-29细胞的异质性粘附能力。（3）Transwell侵袭试验判定微缺氧下细胞的侵袭游走能力。（4）内皮细胞小管形成试验检测体外促进新生血管形成的能力。（5）将HT-29细胞微缺氧处理0、6、12、24、48h,明胶酶谱分析检测分泌的MMP-2/9活性;RT-PCR和Western blot检测OPN mRNA和蛋白表达;提取胞核蛋白,Western blot检测胞核内NF-κB/p65蛋白表达。结果:（1）随着时间的延长,HT-29细胞的粘附率逐渐增加。微缺氧处理后的细胞在各时段的粘附率均明显高于对照组。（2）微缺氧24h,HT-29细胞穿过微孔膜的细胞数为（185.6±8.4）,对照组为（103.7±6.2）。（3）微缺氧组形成的管状结构数为（28.5±3.6）,明显多于对照组（12.4±2.8）,其差异具有统计学意义（P<0.01）。（4）微缺氧6h,MMP-2/9活性无明显变化,随着微缺氧时间的延长,其活性逐渐上调,24h达顶峰,48h与24h无显著差异。（5）HT-29细胞在微缺氧的诱导下, OPNmRNA和蛋白以及胞核内NF-κB/p65蛋白的表达趋势与MMP-2/9活性变化趋势类同。结论:微缺氧能诱导HT-29细胞异质性粘附能力、侵袭游走能力显著增加,促进新生血管形成,上调MMP-2/9活性而促进其向恶性表型转化。本实验检测到在微缺氧下OPN、胞核内NF-κB/p65和MMP2/9普遍上调,且时限同步,因此,我们推测:OPN-NF-κB可能是微缺氧下继HIF-1α之外的另一重要调控途径,该调控途径与微缺氧诱导的恶性表型密切相关。第四部分OPN反义寡核苷酸对微缺氧下人结肠癌细胞HT-29体外侵袭转移潜能的影响目的:观察靶向OPN的反义寡核苷酸（ASODN）对微缺氧下HT-29细胞侵袭转移潜能等的影响,探讨OPN与微缺氧诱导的肿瘤恶性表型的关系。方法:（1）合成ASODN,以Lipofectamine为载体,将其转染入微缺氧下高表达OPN的HT-29细胞。（2）Western blot行OPN ASODN抑制OPN蛋白表达的量效关系和特异性分析。（3）RT-PCR检测转染细胞微缺氧下OPNmRNA的表达。（4）MTT检测转染的HT-29细胞微缺氧下的增殖活性。（5）HT-29细胞的异质性粘附能力、侵袭游走能力、促进新生血管形成的能力、OPNmRNA表达和胞核内NF-κB/p65蛋白表达的检测方法同前。结果:（1）ASODN组OPN蛋白表达较各对照组明显下调（p<0.01）,其下调的幅度随OPN ASODN浓度升高而增强,但这种增强趋势在浓度为10umol/L和20umol/L之间已不明显（p>0.05）。（2）微缺氧诱导的OPN蛋白和mRNA表达被靶向OPN的ASODN特异性地抑制,表达量分别是对照组的35.4%和31.5%。（4）ASODN组HT-29细胞的（A570）值明显低于各对照组（p<0.01）,生长抑制率（IR）达41.6±1.2%。（5）ASODN组HT-29细胞在各时限点的黏附率均明显降低;穿过微孔膜的细胞数仅为52.6±3.8个;明胶酶活性显著下降;形成管状结构的数仅为12.4±1.8;胞核内的NF-κB/p65蛋白表达下调了61.2%。与各对照组相比,差异具有统计学意义（p<0.01）。结论:靶向OPN的ASODN明显抑制微缺氧诱导的OPNmRNA和蛋白表达,并显著拮抗微缺氧诱导的细胞增殖、异质性黏附、侵袭游走和新生血管形成,OPN在微缺氧促进肿瘤向恶性表型转化中起着重要作用;阻抑OPN的表达,胞核内NF-κB/p65表达、MMP2/9的活性随之下调,提示NF-κB和MMP-2/9也可能参与微缺氧诱导的恶性转化,并且是OPN的下游调控基因。OPN-NF-κB可能是微缺氧下继HIF-1α之外的另一重要调控途径,该调控途径在对微缺氧下肿瘤生物学行为,尤其是侵袭能力的调控中可能扮演关键角色。利用实体瘤的缺氧这一固有属性,可以考虑将OPN作为抑制肿瘤侵袭、转移新的靶点。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：OPN 反义寡核苷酸对微缺氧下人结肠癌细胞HT-29 体外侵袭转移潜能的影响
• 前言
• 第一部分 OPN 在大肠癌原发癌灶侵袭边缘的表达与肝转移的关系
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 离体缺氧模型的制备和鉴定以及缺氧对人结肠癌细胞HT-29 生长活力的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三部分 微缺氧对人结肠癌细胞HT-29OPN和NF-κB表达及其侵袭能力的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第四部分 OPN反义寡核苷酸对微缺氧下人结肠癌细胞HT-29体外侵袭转移潜能的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 附图
• 文献综述
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 攻读博士学位期间参与的其他研究课题