烟草钙依赖蛋白激酶基因分析与作用底物筛选

论文摘要

钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase/calmodulin-like domain protein kinase,CDPK）普遍存在于植物、藻类及部分原生动物中，广泛分布于植物的各种组织且在空间表达存在明显差异。植物CDPK的N端可变区豆蔻酰基化序列含有亚细胞定位信息。N端豆蔻酰化是膜定位所必需的，许多CDPK的N端都有豆蔻酰化位点，且它们被定位到细胞质、细胞核、质膜、内质网、过氧化酶体、线粒体外膜上，从而参与了多种Ca2+介导的信号通路。本研究的内容主要包括两个方面：一是以拟南芥、普通烟草和烟草属其它种中已知的CDPK序列检索绒毛状烟草基因组框架图数据库，获得绒毛状烟草CDPK基因，并对其基因结构、GC含量、系统进化关系、主坐标和基因表达谱进行分析。二是酵母双杂交cDNA文库及NtCDPK12诱饵载体的构建、烟草NtCDPK12作用底物的筛选及分析。（1）本试验通过生物信息学技术分离得到25个绒毛状烟草CDPK基因，它们均具有完整的开放读码框和CDPK典型结构，且大部分含有4个EF手指结构；系统进化树和主坐标分析证实这25个CDPK分布于4个亚家族中；RT-PCR分析显示，绒毛状烟草CDPK基因家族的空间表达存在明显的差异性，它们的表达模式分为4类。这些可为进一步阐明CDPK基因家族在钙信号转导过程中的功能及分子机制奠定重要基础。（2）由质粒PCR和测序结果可知我们得到正确的诱饵载体pGBKT7-NtCDPK12q。该诱饵载体在SD/-Trp固体培养基上的菌落直径大于2mm，接种到SD/-Trp液体培养基中摇菌12h后其OD600值大于0.8，阳性克隆在SD/-Trp-Ade-His培养基无法生长，说明该重组载体无自我激活性和毒性，可用于酵母双杂交。（3）以普通烤烟品种K326为试验材料，构建烟草酵母双杂交cDNA文库。通过对文库的转化率、滴定度和文库插入片段进行检测可知，本试验构建的cDNA文库的转化率和滴定度分别为2.0x107和3.0x107cfu/mL，文库插入的片段大小大部分位于500-1000bp之间，符合酵母双杂交对文库的要求。（4）利用酵母细胞融合杂交的方法将含有诱饵载体pGBKT7-NtCDPK12q的Y2H Gold酵母细胞与含有cDNA文库的Y187酵母细胞进行融合杂交。杂合子经过DDO/X/A平板和QDO/X/A平板两次筛选后得到阳性克隆。将阳性克隆送去测序，将测序结果进行比对分析，得到4类结果：RNase H家族蛋白、GTBP-1、GAG-POL precursor和一种未知蛋白，其中比例最高的是一种RNaseH家族蛋白，本研究将其命名为NtPS1。（5）通过对NtPS1和NtCDPK12进行定量分析，其结果表明，NtPS1和NtCDPK12均属于泛表达基因，表达量在茎中最多，而在根﹑叶和花中的表达量没有明显差异。干旱诱导后的NtCDPK12和NtPS1在茎中表达量6h时发生明显变化，表达水平最高，随着胁迫时间的延长，表达量水平逐渐恢复正常；NtCDPK12和NtPS1在叶中的表达量的变化规律没有茎中的明显，但12h后它们的表达量均增加。高盐诱导后的NtCDPK12和NtPS1在茎中的表达水平6h时出现上调现象，随着胁迫时间的延长，表达量逐渐恢复到正常水平附近。从而进一步说明NtCDPK12和NtPS1可能参与了烟草的干旱和高盐胁迫的响应过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 烟草概述
• 1.1.1 烟草属的分类和起源
• 1.1.2 烟草基因组计划研究概述
• 1.2 CDPK 的基本特性及作用
• 1.2.1 CDPK 的结构
• 1.2.2 CDPK 亚细胞定位和组织表达
• 1.2.3 CDPK 的活性调控
• 1.2.4 CDPK 在植物信号转导中的作用
• 1.2.5 CDPK 的底物及抑制剂
• 1.3 酵母双杂交在 CDPK 功能分析中的应用
• 1.4 本实验的目的意义、主要内容及技术路线
• 1.4.1 目的和意义
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 技术路线
• 第二章 绒毛状烟草 CDPK 基因家族分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 数据来源
• 2.1.3 基因结构分析
• 2.1.4 蛋白结构域分析
• 2.1.5 基因 GC 含量计算
• 2.1.6 序列比对与系统进化树分析
• 2.1.7 主坐标分析
• 2.1.8 基因表达分析
• 2.2 结果分析
• 2.2.1 绒毛状烟草 CDPK 基因的结构特征
• 2.2.2 绒毛状烟草 CDPK 的序列特征和蛋白结构域
• 2.2.3 绒毛状烟草 CDPK 基因的 GC 含量
• 2.2.4 系统进化树分析
• 2.2.5 主坐标分析
• 2.2.6 绒毛状烟草 CDPK 基因的表达分析
• 2.3 讨论
• 第三章 诱饵载体的构建及其毒性、自我激活性分析
• 3.1 试验材料
• 3.2 试验试剂及培养基
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 总 RNA 提取
• 3.3.2 cDNA 的合成
• 3.3.3 PCR 反应
• 3.3.4 PCR 产物回收
• 3.3.5 PCR 产物的克隆及测序
• 3.3.6 pMD18-T 重组质粒和 pGBKT7 酶切、回收、连接及转化
• 3.3.7 诱饵质粒的提取及 PCR 检测
• 3.3.8 酵母感受态细胞的制备
• 3.3.9 诱饵载体的转化
• 3.3.10 诱饵载体毒性及自我激活性检测
• 3.4 结果分析
• 3.4.1 烟草 NtCDPK12q 和 NtCDPK12j 的 PCR 扩增
• 3.4.2 诱饵载体的构建
• 3.4.3 诱饵载体的转化及自我激活和毒性鉴定
• 3.5 讨论
• 第四章 烟草酵母双杂交 cDNA 文库构建及评价
• 4.1 试验材料
• 4.2 试验试剂及培养基
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 RNA 的提取及检测
• 4.3.2 第一链 cDNA 合成
• 4.3.3 LD-PCR 扩增 ds cDNA
• 4.3.4 Y187 酵母感受态细胞的制备
• 4.3.5 制备酵母双杂交 cDNA 文库
• 4.3.6 文库滴定度的检测
• 4.3.7 酵母质粒的提取
• 4.3.8 文库插入片段的检测
• 4.4 结果分析
• 4.4.1 总 RNA 提取及 ds cDNA 合成
• 4.4.2 文库的转化效率及文库滴定度的检测
• 4.4.3 文库插入片段的检测
• 4.5 讨论
• 第五章 NtCDPK12 作用底物筛选及分析
• 5.1 试验试剂及培养基
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 酵母双杂交互作子的筛选
• 5.2.2 酵母质粒的提取及转化
• 5.2.3 阳性克隆的测序
• 5.2.4 定量分析
• 5.3 试验结果
• 5.3.1 NtCDPK12 作用底物的筛选
• 5.3.2 测序结果及分析
• 5.3.3 定量分析
• 5.4 讨论
• 第六章 结论
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 6.3 工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介