重组人促红细胞生成素对大鼠视神经不完全损伤的保护研究

论文摘要

目的:外伤性视神经病变（traumatic optic neuropathy ,TON）是外力经眶骨传导的对视神经（optic nerve,ON）的间接损伤。损伤后可以没有外部或最初眼底镜下的视神经损伤的表现,却常常导致暂时或永久性的视力障碍。损伤的确切机制及病理过程尚不清楚。目前临床还没有确凿的治疗方案,疗效欠佳。目前神经生长因子、抗氧化剂、谷氨酸受体拮抗剂等神经保护剂在视神经损伤治疗的应用大多还仅现于动物实验。本实验通过建立外伤性视神经损伤的动物模型,早期应用重组人促红细胞生成素（ recombanant human erythropoietin,rhEPO）,设立对照组,观察大鼠视网膜（retinal ganglion RG）和ON形态,检测生长相关蛋白-43（growth associated protein-43,GAP-43）及GAP-43mRNA的表达,为临床应用提供实验理论和依据,旨在探讨治疗视神经损伤的新方法。方法:选用清洁级健康成年SD大鼠126只,雌性,体重230g-250g,外眼及眼底检查正常。随机分为正常对照组（6只12眼）,损伤对照组（60只60眼）即视神经钳夹十生理盐水组,EPO治疗组（60只60眼）即视神经钳夹十EPO组三组。损伤对照组和EPO治疗组再按损伤后存活的时间随机分为1天,4天,7天和14天,28天5组。损伤组与治疗组每个时间点各12只眼。除正常对照组外,每只动物均为左眼ON损伤,右眼不损伤。各时间点和正常对照组的12只眼中,3只用于制作RG和ON切片,进行HE染色后光镜下RG形态学变化的观察及计数和ON形态观察、3只用于制作ON电镜切片,进行醋酸铀和构椽酸铅双重染色后电镜下行视ON形态观察和轴突计数,6只用于制作ON冰冻切片和ON总RNA提取,分别行视神经组织GAP-43和GAP-43mRNA定性和半定量的检测。用压力恒定的反向镊,于球后2mm处夹持视神经20s,制作ON损伤动物模型。治疗组于损伤后立即用消毒后的10μL微量推进器吸取药物,向玻璃体腔内注射rhEPO 2μL,即200ng/眼,对照组玻璃体腔内注射生理盐水2μL。各组动物在达到预定存活时间后,完整摘出眼球和ON,制备RG和ON切片,分别进行光镜及电镜下观察和计数,和采用免疫组织化学方法及反转录一聚合酶链反应技术（RT-PCR）从蛋白水平及分子水平检测在不同处置方法后不同的恢复时间点ON轴突中GAP-43及其mRNA表达及程度。所有数据资料录入微机,用SPSS（10.0）软件包进行统计学分析,集中趋势及离散趋势述用均数及标准差描述,单因素多组间的比较用单因素方差分析,单因素两组间比较用t检验,检验水准（α=0.05）。结果:1染色的RG切片形态观察和视网膜神经节细胞（retinalganglion cell,RGC）计数:ON损伤后1、4天,三组比较病理形态和RGCs数目无明显改变。7、14、28天,损伤组,治疗组同正常对照组相比,可见RGCs层部分胞核体积缩小,染色加深,呈核固缩形态,数量较正常组减少,呈现加重趋势。7、14和28天治疗组的RG病理改变较同时间点损伤组明显减轻。1天、4天时,三组RGCs个数差异无显著性（p>0.05）;治疗组7天、14天和28天RGCs个数均高于对应时间点损伤组,差异有显著性（p<0.05）。4天、7天、14天和28天两组RGCs数均随时间推移递减,差异有显著性（P<0.05）。2 HE染色的ON切片形态学观察:损伤组:l天ON纤维束肿胀,散在神经纤维空泡变性。4天纤维束肿胀加重,神经纤维空泡变性。7天纤维束肿胀,片状神经纤维空泡变性。14天纤维束肿胀,大片神经纤维空泡变性,大空泡形成。28天纤维束肿胀稍减轻,大片神经纤维空泡变性,较多大空泡。损伤1天后治疗组较损伤组病变无明显差异,4天、7天、14天、28天治疗组较损伤组病变明显减轻,神经纤维空泡变性减少,纤维束肿胀较轻。3 ON超微形态学观察及计数3.1形态学超微观察:损伤组:可见多数轴突呈现低电子密度,轴突内结构呈颗粒状变性,部分轴突内可见线粒体明显肿胀和空泡化,部分轴突的轴膜与髓鞘间有间隙形成,髓鞘松解,结构紊乱,轴浆内空泡形成,微管、微丝、线粒体明显减少或消失。治疗组:也可见到轴浆呈现低电子密度,颗粒状变性等征象,但轴浆内线粒体肿胀程度较损伤组明显减轻,线粒体、微管、微丝较损伤组明显增多,髓鞘排列整齐,层次清晰,脱髓鞘较轻。3.2超微观察计数损伤后1天三组轴突数目无明显差异。4天、7天、14天、28天时治疗组轴突数均高于同时间点损伤组,差异有显著性（p<0.05）;两组轴突随时间推移递减,差异有显著性（P<0.05）。4 GAP-43及mRNA定性和半定量检测免疫组化及RT-PCR结果显示伤后1天三组均无表达;4、7天损伤组和治疗组GAP-43及GAP-43mRNA均表达阳性,但差异不明显;14天、28天,治疗组GAP-43及GAP-43mRNA表达呈强阳性,损伤组表达呈弱阳性,治疗组GAP-43及GAP-43mRNA表达强于损伤组,半定量分析差异有显著性（P<0.05）。结论:1 GAP-43是反映ON再生的可靠指标。2 RhEPO玻璃体腔内注射可以促进视神经损伤后RGCs的存活,对RGCs起到保护作用。3 ON不全损伤后玻璃体内注射rhEPO,可以促进ON轴突的修复、再生。4 ON不全损伤后玻璃体内注射rhEPO,可以促进视神经GAP-43mRNA、GAP-43蛋白的表达,可能在视神经损伤后ON的再生、修复的机制中起重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 重组人促红细胞生成素对大鼠视神经不完全损伤的保护研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 促红细胞生成素在眼科应用前景
• 致谢
• 个人简历