论文摘要
第一部分人类睾丸高表达基因THEG-2的克隆及序列分析目的:克隆睾丸发育及生精相关基因,为进一步研究其功能、精子发生的分子调控机制奠定基础。方法:从二级表达序列标签（expressed sequence tags, EST）数据库ZooDDD中获得人类正常睾丸表达的EST,检索其同源序列,应用Biolign软件拼接成基序（contigs）,GeneScan软件预测对应基因组序列中的外显子位置,并将其拼接成完整的编码序列;针对开放阅读框设计引物序列,采用RT-PCR从人类睾丸组织中克隆新基因的cDNA,分析该基因在人类各脏器组织中的表达,并对测序结果进行生物信息学分析。结果:在人类22号染色体的49311047 K—49368620K间克隆出一新基因THEG-2,编码序列全长267 bp,编码88个氨基酸,分子量MW10601.09,等电点4.32。RT-PCR证实该基因开放阅读框正确,在人类睾丸组织中高表达,获得GenBank登录号EU079024。预测THEG-2蛋白理论等电点为pI 4.32,相对分子量为MW10601.09,其亚细胞定位可能位于细胞核,功能预测为生长因子。结论:获得人类睾丸高表达基因THEG-2,为进一步研究该基因的生物学功能和表达调控奠定了基础。第二部分小鼠睾丸特异性基因TSEG-2的克隆及其在睾丸发育过程中的表达目的:利用模式生物小鼠,探讨睾丸高表达基因THEG-2在睾丸发育过程中的作用。方法:通过dbEST数据库检索出与THEG-2基因高度同源的EST序列,构建EST叠加群（contigs）,Biolign软件拼接,GeneScan软件预测contigs对应的基因组序列中的外显子、内含子;针对开放阅读框设计引物序列,采用RT-PCR从小鼠睾丸组织中克隆新基因的cDNA,分析该基因在小鼠睾丸不同发育阶段中的表达,并对测序结果进行生物信息学分析。结果:成功克隆了THEG-2高度同源的小鼠睾丸新基因TSEG-2,全长451 bp,开放阅读框为267 bp,编码88个氨基酸。RT-PCR证实该基因开放阅读框正确,TSEG-2在小鼠睾丸组织中特异性表达,在4、9、14、18、21、38日龄和2、6月龄小鼠睾丸组织中呈现规律性表达,且与小鼠其它cDNA无同源性,获得GenBank登录号EU079025。功能区分析发现,小鼠TSEG-2 cDNA序列定位于染色体15qE3,为可溶性非分泌型蛋白,有2个可能的蛋白激酶C （PKC）磷酸化位点,1个酪蛋白激酶Ⅱ（ CK2）磷酸化位点,并可能是一种核蛋白。结论:获得小鼠睾丸特异性表达基因TSEG-2,与睾丸发育各阶段密切相关。第三部分小鼠睾丸特异性基因TSEG-2在隐睾中的表达特征目的:建立雌二醇诱导的小鼠隐睾模型,并对其进行组织形态学观察,同时对新克隆的TSEG-2基因在隐睾模型的表达特征进行研究。方法:35只雄性新生BABL/C仔鼠随机分为正常对照组、溶剂对照组和实验组。实验组（n=15）于生后第3-30天皮下注射17-β雌二醇4μl （4μg/d）,溶剂对照组（n=10）皮下注射等量丙二醇,正常对照组不给予任何处理。生后第35天,观察各组睾丸位置、大小,采用HE染色、透射电镜进行组织形态学观测。采用RT-PCR方法研究TSEG-2基因在隐睾模型中的表达特点。结果:实验组隐睾发生率100%,均为双侧隐睾,而对照组和溶剂对照组无隐睾发生。与对照组比较,实验组睾丸大小明显缩小,生精小管上皮数目减少,管腔消失,精母细胞和精原细胞核皱缩,支持细胞和间质细胞核仁空泡变性,未见成熟精子。对照组和溶剂对照组TSEG-2基因高表达,而TSEG-2基因在隐睾模型组中表达显著下调。结论:通过雌二醇干预法能成功诱导小鼠隐睾模型,根据TSEG-2基因的表达特征,可推测这个新基因可能在小鼠的睾丸发育及精子发生过程中起着重要作用。