论文题目: RNA干扰在抑制病毒基因表达与复制中的作用研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 邬开朗
导师: 吴建国
关键词: 干扰,人乙型肝炎病毒,人免疫缺陷病毒,病毒复制
文献来源: 武汉大学
发表年度: 2005
论文摘要: RNA干扰(RNA interference,RNAi)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象。是细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA(double-strand RNA)时,使同源mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。Brummekamp等人构建了一个可以在细胞内转录产生siRNA的载体系统,同样具有RNA干扰作用,这些发现为研究基因表达和抑制病毒感染等方面开辟了一个新的领域。 在过去几年时间里,RNAi已广泛用于抗病毒感染的研究中。有多篇论文报告利用RNAi抑制病毒复制,如脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、人免疫缺损病毒(HIV-1)、兽棚病毒flock house virus(FHS)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、登革病毒(deague virus)、丙型肝炎病毒(HCV)、流感病毒(influenza virus)、乙型肝炎病毒(HBV)、乳头瘤病毒(HPV)、冠状病毒(SARS-COV)等。利用RNAi在细胞水平抑制病毒复制的研究取得了很好的结果,在动物上进行利用RNAi的抗病毒研究,如钟南山等人在猴子身上进行了RNA干扰抗SARS-COV的研究,也取得很好的结果。在以上的研究中大多数是用的人工合成21nt的dsRNA。然而基于载体表达siRNA的RNA干扰技术在最近的研究更多的被人们采用,每个载体表达特异的siRNA能降解特异的靶标。 已有报道HIV—1通过其基因的突变逃脱RNA干扰作用,毫无疑问,HBV基因的突变也会导致病毒对RNA干扰的抗性,要对付病毒逃避RNA干扰的这种机制,通常采取的策略是将RNA干扰作用的靶位点选择在病毒基因的保守区即不易发生突变的区域,在本研究中我们采用的策略是利用同一个载体同时表达两个siRNA针对HBV的S和X基因的方法,以克服病毒利用突变逃避RNA干扰作用。 本研究采用载体表达siRNA的方法,进行RNA干扰抑制HBV基因表达和复制的研究。我们设计合成一对64nt的单链DNA片段,其中包含有19nt序列是与HBV基因同源的,即siRNA作用的靶位点,两条单链DNA链退火可以互补形成双链DNA片段,并可以克隆到pSliencer 2.1-U6质粒上的Bam H Ⅰ—Hind Ⅲ位点。为了获得一个快速筛选载体pLucF,可以将靶基因序列如HBS或HBX基因与报道
论文目录:
中文摘要
英文摘要
引言
第一章 前言
1.1 RNAi及发现
1.2 双链RNA(dsRNA)的生化性质
1.3 RNAi的一些作用机制模型
1.4 RNAi生理作用及可能的用途
1.5 RNAi的作用特点
1.6 siRNA的设计及制备
1.6.1 siRNA的设计
1.6.2 siRNA的制备
1.7 HBV及其相关的疾病
1.7.1 HBV分子生物学及其研究进展
1.7.2 肝脏是嗜肝DNA病毒感染的靶器官
1.8 HCC的分子病理学
1.8.1 HBV病毒基因在HCC形成过程中的作用
1.9 HIV及相关疾病
1.9.1 HIV生物学特征
1.9.2 HIV的致病机理
1.9.3 HIV流行病学
1.9.4 AIDS的治疗进展
1.10 HBV和HIV混合感染
1.11 本研究的目的和意义
第二章 利用载体产生siRNA来抑制HBV的基因表达和复制
2.1 引言
2.2 材料
2.2.1 菌种、细胞和质粒
2.2.2 工具酶
2.2.3 试剂盒
2.3 方法
2.3.1 RNA干扰靶序列的选择
2.3.2 siRNA表达质粒的构建
2.3.3 细胞培养、冻存和复苏
2.3.4 转染细胞
2.3.5 plucF-HBs和plucF-HBx融合质粒的构建
2.3.6 荧光色素酶的测定
2.3.7 乙型肝炎表面抗原的检测
2.3.8 总RNA的提取和RT-PCR检测
2.3.9 肝病毒复制中间体(core associated DNA)荧光定量PCR检测
2.4 结果
2.4.1 选择siRNA靶位点在HBV基因组及主要mRNA中的位置
2.4.2 融合基因plucF-HBs和plucF-HBx构成示意图
2.4.3 产生siRNA的模板
2.4.4 表达siRNA的质粒构建
2.4.5 小分子干扰RNA(siRNA)示意图
2.4.6 荧光色素酶活性的定量分析
2.4.7 用RT-PCR检测siRNA对HBS和HBX基因表达的影响
2.4.8 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的测定
2.4.9 siRNA对HBV复制的影响
2.5 讨论
第三章 利用同一载体同时产生两个siRNA抑制HBV复制
3.1 引言
3.2 材料和方法
3.3 方法
3.3.1 同时产生两个siRNA的质粒构建
3.3.2 荧光素酶分析
3.3.3 RT-PCR分析
3.3.4 HBsAg检测
3.3.5 HBV DNA和HBV复制中间体的荧光定量PCR检测
3.4 结果
3.4.1 产生双siRNA质粒的构建
3.4.2 用荧光素酶分析检测HBx siRNA对HBs和HBx表达的影响
3.4.3 用RT-PCR检测HBsxsiRNA对HBs和HBx表达的影响
3.4.4 检测HBsxsiRNA对HBV的影响
3.4.5 HBV DNA和HBV复制中间体的荧光定量PCR检测结果
3.5 讨论
第四章 双siRNA同时抑制HBV和HIV病毒基因的表达和复制
4.1 引言
4.2 材料
4.3 方法
4.3.1 针对HIV-1gp120有效的siRNA作用的靶位点的筛选
4.3.2 同时产生两个siRNA的质粒构建
4.3.3 荧光素酶分析
4.3.4 RT-PCR分析
4.3.5 HBsAg检测
4.3.6 HBV DNA和HBV复制中间体的荧光定量PCR检测
4.3.7 HBV-HIVsiRNA对HIV-1复制影响的检测
4.4 结果
4.4.1 产生双siRNA质粒的构建
4.4.2 用荧光素酶分析检测HIVsiRNA对HBs和HIVgp120表达的影响
4.4.3 乙型肝炎表面抗原的检测
4.4.4 用RT-PCR检测HBV-HIVsiRNA对HBs和HIVgp120表达的影响
4.4.5 HBV DNA和HBV复制中间体的荧光定量PCR检测结果
4.4.6 HBV-HIVsiRNA对HIV-1复制影响的检测
4.5 讨论
第五章 总结和展望
参考文献
附录Ⅱ 论文涉及的试剂及其配制
附录Ⅲ 在读期间发表的文章
致谢
发布时间: 2006-03-27
参考文献
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