猪应答猪肺炎支原体感染之特异性IgA抗体分泌规律的研究

论文摘要

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是引起猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumoniae of swine,Mps又称猪气喘病）的主要病原。该病以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点,其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降,而且它能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障,从而引起其他致病茵的继发感染。当病原从黏膜途径侵入机体,主要刺激机体黏膜免疫产生SIgA抗体。SIgA抗体在黏膜免疫中起到重要的作用。1对猪肺炎支原体组织毒毒力进行鉴定,并制备了标准阴阳性支气管-肺泡灌洗液样本。本次研究以总蛋白作为标准品进行校正,降低了样本采集而产生的误差.2利用实验室保存的猪肺炎支原体P36、P46、P97R1阳性质粒,用大肠杆菌表达系统表达了多种免疫蛋白；为猪肺炎支原体抗体检测方法的建立奠定了基础。3建立了单个蛋白的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化。本次实验重点为对封闭液进行优化,降低封闭液与样本之间的非特异性反应,最终选择1%酪蛋白作为封闭液,然后将ELISA其它工作条件进行固定,用于检测包被不同蛋白后样本特异性SIgA抗体水平。优化并固定的程序如下：将待包被蛋白用包被液稀释至2μg/mL。包被96孔酶标板,100μL孔37℃1h,4℃包被过夜；1%酪蛋白,200μL/孔37℃封闭2h；支气管-肺泡灌洗液样本1：20稀释,鼻试子样本不稀释,100μL/孔37℃2h。羊抗猪IgA-HRP 1:10000稀释100μL/孔37℃1h；然后用TMB显色液在37℃作用12min,最后用2MH2SO4终止反应。此外,检测血清中特异性的IgA间接ELISA检测方法的工作条件为：将待包被蛋白用包被液稀释至4μg/mL。包被96孔酶标板,100μL/孔37℃lh4℃包被过夜；1%酪蛋白200μL/孔 37℃封闭1h；血清样本1：20稀释100μL/孔37℃1h。羊抗猪IgA-HRP稀释至1：10000,100gL/孔 37℃1h；然后用TMB显色液在37℃作用10min,最后用2M H2SO4终止反应。4建立了用于检测猪呼吸道IgA抗体的双抗夹心ELISA方法,并对此方法进行了优化,优化后的程序如下：将待鼠抗猪IgA单抗蛋白用包被液稀释至1μg/mL。包被96孔酶标板,100μL/孔 37℃1h,4℃包被过夜；1%酪蛋白200μL/孔37℃封闭2h；支气管-肺泡灌洗液样本1：100稀释100μL/孔37℃2h。羊抗猪IgA-HRP 1:15000稀释,100μL/孔37℃1h；然后用TMB显色液在37℃作用5min,最后用2M H2SO4终止反应。5本试验所建立的间接ELISA方法对Mhp组织强毒攻毒后的鼻试子样本中特异性SIgA进行检测发现：Mhp阴性猪在攻毒后,在第6d能够检测到特异性SIgA抗体并在16d达到高峰；Mhp阳性猪在攻毒后的24小时内特异性SIgA抗体水平都开始下降,到第2d达到最低,随后开始恢复。P97R1、P46、P36三种蛋白的特异性SIgA的分泌规律具有一致性。这表明,P97R1、P46、P36三种蛋白都可以作为包被抗原用于呼吸道中Mhp特异性SIgA的ELISA建立。Mhp阴性猪感染后,在攻毒后第7d能够检测到血清中的P97R1特异性的IgA抗体并一直升高至28d；然而,整个试验过程都未能检测到P46,P36特异性IgA抗体.

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语及符号
• 第一篇 文献综述
• 1 黏膜抗体在疫苗效力检验中的意义
• 1.1 简介
• 1.2 疫苗免疫效果的评价与免疫监测
• 1.3 黏膜抗体的功能
• 1.4 黏膜抗体在疫苗效力评价中的研究
• 1.5 展望
• 2 猪肺炎支原体免疫学研究进展
• 2.1 P97蛋白
• 2.2 P46蛋白
• 2.3 P36蛋白
• 2.4 脂蛋白类P65
• 2.5 NrdF蛋白
• 3 猪支原体肺炎诊断方法研究进展
• 3.1 基层常用的诊断方法
• 3.2 实验室常用的诊断方法
• 参考文献
• 第二篇 研究内容
• 第一章 主要包被抗原的表达及免疫原性的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种与血清
• 1.2 主要材料与方法
• 1.3 主要仪器
• 1.4 猪肺炎支原体主要蛋白P97R1、P46、P36的表达和鉴定
• 2 实验结果
• 2.1 各蛋白浓度测定结果
• 2.2 表达蛋白SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定结果
• 参考文献
• 第二章 SIgA-间接ELISA标准品的制备
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物、菌株、肺泡灌洗液
• 1.2 主要试剂
• 1.3 标准阴性支气管肺泡灌洗液样本的制备
• 1.4 猪肺炎支原体标准阳性灌洗液的制备
• 1.5 标准Mhp阴阳性肺泡灌洗液样本的校准
• 1.6 间接ELISA操作
• 2 实验结果
• 2.1 标准Mhp阴阳性肺泡灌洗液样本的校准结果
• 2.2 标准阴性灌洗液样本的制备结果
• 2.3 标准阳性灌洗液样本的制备结果
• 2.3.1 Mhp组织强毒毒力实验结果
• 2.3.2 阳性BLAF标准品的制备结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 MHP单蛋白特异性IgA-间接ELISA方法及猪IgA双抗夹心ELISA方法的优化及建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 MHP单蛋白特异性IgA-间接ELISA的优化及建立
• 1.2.2 猪呼吸道总IgA双抗夹心ELISA检测方法的优化及建立
• 2 实验结果
• 2.1 MHP单蛋白特异性IgA-间接ELISA的优化及建立
• 2.1.1 样本稀释液中不加相应封闭液时最佳封闭液选择
• 2.1.2 样本稀释液中加相应封闭液时最佳封闭液选择
• 2.1.3 1%酪蛋白和1%明胶做为封闭液时,封闭液对不同种类临床样本检测的影响
• 2.1.4 P97R1、P46、P36单一蛋白包被浓度和一抗稀释度的确定
• 2.2 猪呼吸道总IgA双抗夹心ELISA检测方法的优化及建立
• 2.2.1 SIgA标准阴性灌洗液的验证
• 2.2.2 抗原包被浓度及最佳血清稀释度的确定
• 2.2.3 一抗反应时间优化
• 2.2.4 羊抗猪IgA-HRP最佳稀释度的确定
• 2.2.5 羊抗猪IgA-HRP最佳反应时间的确定
• 2.2.6 双抗夹心ELISA显色时间的确定
• 2.2.7 重复性实验
• 2.2.8 ELISA工作条件的确定
• 2.2.9 标准曲线的绘制
• 2.2.10 鼻试子样本的检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 MHP感染后特异性IgA抗体分泌规律研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 鼻试子中特异性SIgA抗体检测结果的校准方法
• 2.1 鼻试子中总蛋白浓度的测定
• 2.2 间接ELISA实验检测鼻试子样本中总IgA的量
• 2 实验结果
• 2.1 间接ELISA检测鼻试子中总IgA检测结果
• 2.2 鼻试子中总蛋白检测结果
• 2.3 间接ELISA实验检测鼻试子中特异性SIgA水平结果
• 2.4 攻毒后猪血清P97R1、P46、P36特异性IgA抗体的变化规律
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文