4个水稻逆境诱导基因的克隆和功能鉴定

论文摘要

水稻（Oryza sativa L.）是我国主要的粮食作物之一。在水稻的生长发育过程中干旱、冷害、热害、盐害和病虫危害等严重影响水稻的产量和品质。实践证明,利用遗传工程方法是提高水稻抗逆性的有效途径。为此,本论文从水稻低温表达芯片和胁迫诱导表达中筛选出4个与逆境响应相关的基因CRK10、OSK24、LRK1和GT74E2,研究了这些基因逆境胁迫下的表达,通过农杆菌介导的转基因方法获得了超表达转基因水稻植株和CRK10基因T-DNA插入突变体,并对这些转基因及突变体进行了苗期低温、干旱和盐害胁迫处理,对其抗逆性进行了初步分析,探讨了这些基因在抗逆胁迫中的作用。主要结果如下：1.蛋白序列的同源性分析表明,4个逆境诱导表达候选基因编码蛋白种类不同,CRK10是一个Cystein-rich类受体蛋白激酶,OSK24是一个SnRK1b亚类激酶,LRK1是一个Leucine-rich类受体蛋白激酶,GT74E2是一个生长素糖基化转移酶。2.水稻幼苗逆境胁迫下基因表达RT-PCR测定表明,水稻幼苗在4℃、200 mmol/L NaCl、20%PEG-6000、10 mmol/L H2O2胁迫下,CRK10基因受4℃、NaCl和H202胁迫明显诱导。OSK24基因受NaCl、PEG和H202胁迫明显诱导。LRK1基因NaC1逆境诱导。GT74E2基因受4℃、NaCl和H202逆境强烈诱导。3.水稻转基因试验表明,利用农杆菌介导法获得了4个基因超表达转基因植株,通过RT-PCR和潮霉素检测获得了转基因T1代阳性株系,在温室栽培条件下它们在分蘖期和抽穗期的表型正常。4.CRK10基因功能突变体对H202和ABA的敏感性测定表明,H202浸种处理对超表达转基因水稻幼苗根长的影响较野生型小；其T-DNA插入突变体幼苗的根系较野生型对H202更敏感。ABA对该基因功能突变体的发芽影响无明显差异。暗示该基因可能参与水稻H202信号的传导过程。5.超表达转基因植株和T-DNA插入突变体苗期抗逆性鉴定表明,CRK10和OSK24基因超表达均可以增强水稻的抗盐性和耐旱性,但耐冷性下降。GT74E2基因超表达明显降低了水稻幼苗对低温、盐害和干旱的耐性。因此,初步认为,CRK10和0SK24基因可能是正调控水稻的抗旱性和耐盐性,负调控水稻的耐冷性。GT74E2在低温、干旱和盐害反应中发挥负调控作用。6. CRK10、OSK24、LRK1基因的GST融合蛋白诱导和鉴定表明,这3个基因均可以大量诱导表达蛋白。但是,诱导蛋白经过超声波处理和SDS-PAGE检测发现它们都形成了包涵体。因此,它们的诱导和纯化还需进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表 Abbreviation
• 1 前言
• 1.1 植物的逆境
• 1.1.1 植物逆境的分类
• 1.1.2 逆境对植物的伤害
• 1.2 植物对逆境的适应性
• 1.2.1 植物对逆境信号的传导途径
• 1.2.2 植物适应逆境的策略
• 1.3 类受体蛋白激酶基因家族分类和功能鉴定
• 1.3.1 类受体蛋白激酶基因家族的分类
• 1.3.2 富含Cys残基类受体蛋白家族基因在植物抗逆性中的作用
• 1.3.3 富含Leu残基类受体蛋白家族基因在植物抗逆性中的作用
• 1.4 SNRK蛋白激酶基因在植物抗逆性中的作用
• 1.5 植物GT家族基因功能的研究
• 1.6 本课题研究的意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 水稻材料和菌株
• 2.1.2 生化试剂与仪器
• 2.1.3 培养大肠杆菌及农杆菌所用培养基及组培培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水稻幼苗的培养
• 2.2.2 水稻幼苗cDNA的合成
• 2.2.3 CRK10、OSK24、LRK1和GE74E2基因在非生物逆境中的诱导表达
• 2.2.4 CRK10、OSK24、LRK1和GT74E2基因的克隆
• 2.2.5 CRK10、OSK24、LRK1和GT74E2基因超表达载体的构建
• 2.2.6 CRK10、OSK24、LRK1和GT74E2超表达载体转入农杆菌
• 2.2.7 农杆菌介导的水稻愈伤组织的转化
• 2.2.8 CRK10基因T-DNA插入突变体的鉴定
• 2.2.9 超表达转基因植株及T-DNA插入突变体的抗逆性分析
• 2.2.10 CRK10、OSK24和LRK1基因GST融合表达载体的构建
• 2.2.11 GST融合蛋白的诱导表达及检测
• 3 结果与分析
• 3.1 CRK10、OSK24、LRK1和GT74E2基因的结构分析
• 3.1.1 基因的基本信息
• 3.1.2 蛋白序列的同源性分析
• 3.1.3 基因的基因组结构分析
• 3.2 CRK10、OSK24、LRK1和GT74E2基因在非生物逆境下表达
• 3.2.1 水稻叶片总RNA的提取
• 3.2.2 在非生物逆境下基因表达的RT-PCR检测
• 3.3 CRK10、OSK24、LRK1和GT74E2基因克隆和超表达载体构建
• 3.3.1 基因克隆到T-载体
• 3.3.2 基因超表达载体的构建
• 3.4 CRK10、OSK24、LRK1和GT74E2超表达载体转入农杆菌
• 3.5 农杆菌介导的水稻愈伤组织的转化
• 3.5.1 农杆菌介导的水稻愈伤组织的转化
• 3.5.2 超表达转基因植株的PCR检测
• 1代植株的初步筛选'>3.5.3 超表达转基因T₁代植株的初步筛选
• 3.5.4 超表达转基因植株的表达检测
• 1代植株的表型观察'>3.5.5 超表达转基因T₁代植株的表型观察
• 3.6 CRK10基因T-DNA插入突变体的鉴定
• 3.6 1 突变体植株的潮霉素筛选
• 3.6.2 突变体植株纯合子的检测
• 3.6.3 突变体植株纯合子的RT-PCR检测
• 3.6.4 突变体植株的表型观察
• 3.7 超表达转基因植株和T-DNA插入突变体的抗逆性鉴定
• 20₂的敏感性'>3.7.1 CRK10超表达转基因种子及突变体种子萌发对H₂0₂的敏感性
• 3.7.2 CRK10超表达转基因种子及突变体种子发芽对ABA的敏感性
• 3.7.3 超表达转基因植株和T-DNA插入突变体的抗逆性分析
• 3.8 CRK10、OSK24和LRK1基因融合蛋白表达载体构建和诱导
• 3.8.1 基因融合表达载体的构建
• 3.8.2 GST融合蛋白的诱导表达及检测
• 4 讨论
• 4.1 长片段的克隆与质粒转化农杆菌
• 4.1.1 长片段的克隆
• 4.1.2 质粒转化农杆菌
• 4.2 转基因阳性植株的鉴定
• 4.2.1 外源基因整合水平的鉴定
• 4.2.2 外源基因表达水平的鉴定
• 4.3 类受体蛋白激酶基因和GT蛋白基因的功能鉴定
• 4.4 GT74家族成员在植物生长发育巧抗逆性中的功能
• 参考文献
• 附录 常用试剂的配方
• 致谢