论文摘要
癫痫（epilepsy）是一种以神经元反复过度放电为特征的临床综合征,对其机制的研究具有重要的意义。很多文献报道,癫痫在其发生、发展的过程中,除了神经元的明显病理改变外,还伴随着非常显著的星形胶质细胞形态和功能的异常,这些异常反映在细胞形态、数量、代谢活动、酶活性、电生理和蛋白合成等方面。同时,在过去的研究中我们已经证明癫痫的发病与神经-免疫-内分泌网络失衡有关。目前,已有不少的文献报道了关于星形胶质细胞在癫痫发病中的作用,但往往集中在神经、免疫和内分泌因素中的某一方面或两个方面,而对于星形胶质细胞是否可以通过影响大鼠脑内神经-免疫-内分泌网络来诱导癫痫发作、星形胶质细胞如何参与神经元AMPA受体Ga2+通透性的表达调控及其致痫机制的研究则较少。因此本实验共分六个部分着重研究激活的星形胶质细胞对大鼠脑内神经、免疫、内分泌因素的影响、星形胶质细胞对在体及离体神经元NSF及PLCβ1的影响及其与癫痫发病机制的关系,以期了解星形胶质细胞、神经-免疫-内分泌因素与癫痫发病的关系。本实验第一部分:我们以NF-κBp65的核转位作为细胞激活的标志,选择马桑内酯（Coriaria Lactone ,CL）作为激活星形胶质细胞的主要物质,研究了CL对纯化培养的星形胶质细胞的影响,为后面的研究打下基础。将纯化培养的星形胶质细胞随机分为两组,即对照组和CL组,在分别作用2、4、8、12h后终止培养。观察指标:①免疫细胞化学染色显示NF-κBp65表达的变化。②放射免疫分析显示各时段培养液中TNFα、孕酮和IL-1β浓度的变化。③高效液相色谱分析显示各时段培养液中Glu和GABA浓度的变化。结果显示:①马桑内酯作用后2h即可引起星形胶质细胞核内NF-κBp65的表达,8h达高峰,至12h NF-κBp65阳性胞核的百分率和平均光密度仍维持在高水平。②收集各时段的条件培养液,放射免疫分析法显示TNFα和IL-1β浓度分别在马桑内酯作用后8h和2h达高峰,孕酮浓度也在马桑内酯作用后8h达高峰,与对照组比较差异有显著性意义（P<0.05）;高效液相色谱分析显示Glu和GABA浓度在马桑内酯作用后4h达高峰,8h仍然维持在较高水平,与对照组比较差异均有显著性意义（P<0.05）。以上结果提示马桑内酯可激活纯化培养的大鼠海马星形胶质细胞,诱导其产生一系列活性因子,如TNFα、IL-1β、Glu等,并且在CL作用后8h活性最强。本实验第二部分:为了研究激活的星形胶质细胞对大鼠脑内免疫因素的影响,我们将CL作用后8h的星形胶质细胞条件培养液（astrocyte-conditioned medium, ACM）注射入正常大鼠侧脑室,观察大鼠的行为变化,运用免疫组织化学及放射免疫分析的方法,观察大鼠大脑皮质、海马内TNFα和IL-1β免疫反应的变化及脑组织匀浆、脑脊液内TNFα和IL-1β含量的变化。结果显示:①ACM组大鼠在注射ACM后30 min出现癫痫行为,2 h恢复正常。②ACM作用后2h,大鼠大脑皮质及海马TNF-α免疫反应阳性神经元数和平均光密度值明显增高,4h达高峰（P<0.05）,12h恢复正常水平; ACM作用后2 h,大鼠大脑皮质及海马IL-1β免疫反应阳性神经元数和平均光密度值明显增加（P<0.05）,12 h恢复正常水平。③ACM作用后2h大鼠大脑皮质、海马及脑脊液中TNF-α含量均开始增加,4h达高峰（P<0.05）;ACM作用后2 h大鼠大脑皮质、海马IL-1β含量均开始增加,4 h达高峰（P <0.05）,脑脊液中IL-1β含量则在ACM作用后2 h即达到高峰（P <0.05）。以上结果提示马桑内酯激活的星形胶质细胞条件培养液可增强大鼠脑内TNFα和IL-1β的表达,并导致动物痫性发作。本实验第三部分:为了研究激活的星形胶质细胞对大鼠脑内内分泌因素的影响,我们将CL作用后8h的星形胶质细胞条件培养液（astrocyte-conditioned medium,ACM）注射入正常大鼠侧脑室,观察大鼠的行为变化,运用免疫组织化学方法观察大鼠大脑皮质及海马中孕激素受体（PR）表达的变化;运用放射免疫分析方法,观察脑组织匀浆及脑脊液内孕酮含量的变化。结果显示:①ACM组大鼠在注射ACM后30min出现癫痫行为,2h恢复正常。②ACM作用后2h,大鼠大脑皮质及海马PR免疫反应阳性神经元数和平均光密度值明显降低,4h达最低（P<0.05）,12h恢复正常水平。③ACM组大鼠在侧脑室注射ACM后2h,脑脊液中孕酮含量明显升高;而海马组织和大脑皮质中孕酮含量则在注药后4h明显降低,与对照组比较均有显著差异（P<0.05）。以上实验结果提示马桑内酯激活的星形胶质细胞条件培养液可通过降低大鼠脑内孕激素及其受体的表达参与癫痫的发作。本实验第四部分:为了研究激活的星形胶质细胞对大鼠脑内神经因素的影响,我们将CL作用后8h的星形胶质细胞条件培养液（astrocyte-conditioned medium, ACM）注射入正常大鼠侧脑室,观察大鼠的行为变化,运用免疫组织化学及HPLC的方法,观察大鼠大脑皮质、海马内Glu和GABA免疫反应的变化及脑组织匀浆、脑脊液内Glu和GABA含量的变化。结果显示:①ACM组大鼠在注射ACM后30 min出现癫痫行为,2 h恢复正常。②ACM作用后2h,大鼠大脑皮质及海马Glu免疫反应阳性神经元数和平均光密度值明显增高,4h达高峰（P<0.05）,12h恢复正常水平; ACM作用后2 h,大鼠大脑皮质及海马GABA免疫反应阳性神经元数和平均光密度值明显减弱（P<0.05）,12 h恢复正常水平。③ACM作用后2h大鼠大脑皮质、海马及脑脊液中Glu含量均开始增加,4h达高峰（P<0.05）。ACM作用后2 h大鼠大脑皮质、海马及脑脊液中GABA含量均开始降低,4 h达最低（P <0.05）。以上结果提示马桑内酯激活的星形胶质细胞条件培养液可影响大鼠脑内Glu和GABA的表达,并导致动物痫性发作。本实验第五部分:为了研究激活的星形胶质细胞对大鼠脑内及培养的神经元内N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein, NSF）的影响及其对神经元AMPA受体Ca2+通透性表达的调控和在癫痫发病中的作用。我们将CL作用后8h的星形胶质细胞条件培养液（astrocyte- conditioned medium, ACM）注射入正常大鼠侧脑室,观察大鼠的行为变化,运用免疫组织化学方法,观察大鼠大脑皮质、海马内NSF免疫反应的变化。将纯化培养的神经元随机分为3组:1.对照组（无血清培养基组）,2.ACM组,3.CNQX+ACM组。各组细胞分别培养4、8、12h后,免疫细胞化学方法观察NSF表达的变化,Western blot法检测各组NSF含量的变化。结果显示:①ACM组大鼠在注射ACM后30 min出现癫痫行为,2 h恢复正常。②免疫组织化学显示: ACM作用后2h,大鼠大脑皮质及海马NSF免疫反应阳性神经元数和平均光密度值明显降低,4h达最低（P<0.05）,12h恢复正常水平。③培养神经元的免疫细胞化学染色证明ACM组在作用4h及8h时NSF免疫阳性反应产物明显减少,与对照组比较有明显差异（P <0.05）;CNQX+ACM组NSF免疫阳性反应产物与对照组比较无明显差异（P ?0.05）。④Western blot: NSF含量在ACM作用4h及8h时较对照组及CNQX+ACM组明显减少（P <0.05）,而对照组与CNQX+ACM组之间无明显差异（P ?0.05）.以上结果提示马桑内酯激活的星形胶质细胞条件培养液可下调大鼠脑内及培养的神经元内NSF的表达,并导致动物痫性发作,而运用AMPA受体拮抗剂CNQX能阻断其下调作用,提示ACM对NSF的下调作用可能是与AMPA受体有关。本实验第六部分:为了研究激活的星形胶质细胞对大鼠脑内及培养的神经元内磷脂酶Cβ1（PLCβ1）的影响,我们将CL作用后8h的星形胶质细胞条件培养液（astrocyte- conditioned medium, ACM）注射入正常大鼠侧脑室,观察大鼠的行为变化,运用免疫组织化学方法,观察大鼠大脑皮质、海马内PLCβ1免疫反应的变化;将纯化培养的神经元随机分为2组:1.对照组（无血清培养基组）,2.ACM组,各组细胞分别培养4、8、12h后,免疫细胞化学方法观察PLCβ1表达的变化,Western blot法检测各组Plcβ1含量的变化。结果显示:①ACM组大鼠在注射ACM后30 min出现癫痫行为,2 h恢复正常。②免疫组织化学显示: ACM作用后2h,大鼠大脑皮质及海马PLCβ1免疫反应阳性神经元数和平均光密度值明显增加,4h达最高（P<0.05）,12h恢复正常水平。③培养神经元的免疫细胞化学染色证明ACM组在作用4h时PLCβ1免疫阳性反应产物明显增多,与对照组比较有明显差异（P <0.05）。④Western blot: PLCβ1含量在ACM作用4h时较对照组明显增多（P <0.05）.以上结果提示马桑内酯激活的星形胶质细胞条件培养液可上调大鼠脑内及培养的神经元内PLCβ1的表达,并导致动物痫性发作。小结:马桑内酯可激活纯化培养的星形胶质细胞,诱导其合成和分泌一系列活性物质,如TNFα、IL-1β、Glu等。含有这些活性物质的星形胶质细胞条件培养液（ACM）可通过上调TNFα、IL-1β、Glu及PLCβ1的表达,下调孕激素及其受体、GABA及NSF的表达来诱导动物痫性发作,提示星形胶质细胞可能通过打破大鼠脑内免疫-神经-内分泌网络的平衡及可能通过影响AMPA受体的Ca2+通透性来导致动物癫痫发作。
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