论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,以肌强直、肢体震颤和运动减少等症状为主要临床表现。PD病理特征主要是中脑黑质致密带（substantia nigra pars compact,SNpc）多巴胺（dopamine,DA）能神经元缺失。PD的病因至今未完全明了,可能有多种因素参与,如遗传因素、环境因素、氧化应激、炎症反应和神经营养因子缺失等。随着生活水平的提高,环境因素在PD中的作用也日益引起人们的重视。在诸多的环境因素中,业已证实金属离子能促进黑质多巴胺能神经元的死亡。神经化学、临床以及流行病学方面的研究都提示长期接触锌等二价金属离子可能参与PD的发病。临床尸检证明二价金属离子锌在PD病人的黑质（substantia nigra,SN）区含量增高50—54%,而在6—羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6—OHDA）制备的PD模型大鼠SN区经质谱分析技术检测锌离子的含量也有明显增高,这就提示SN内的高锌离子可能与PD的发病之间存在某种联系。最近的实验证实向大鼠SN内注射ZnCl2可以导致DA能神经元凋亡,说明SN内的高锌离子可能是通过诱导DA能神经元凋亡从而参与PD的发病。但是到目前为止,锌离子诱导凋亡的具体机制还不清楚。为研究锌离子对DA能神经元的损伤作用及探讨其引起神经元凋亡的可能机制,本实验选择了MES23.5DA能细胞系作为研究对象。首先应用MTT法评价不同浓度锌离子对细胞存活率的影响并利用Hoechst 33258染色观察细胞核的凋亡改变,以证实锌离子是否能诱导细胞凋亡;为了检验锌离子是否影响细胞的功能,采用蛋白免疫印迹技术（western blots）及半定量逆转录聚合酶链反应（semi-quantitive reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测锌离子对酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxlase,TH）蛋白及mRNA表达的影响,并利用高效液相色谱电化学检测法（high performance liquidchromatography-electrochemical detection,HPLC-ECD）观察了锌离子对细胞中DA含量的影响;为了进一步探讨锌离子引起细胞凋亡的可能的机制,我们采用全细胞膜片钳技术记录细胞膜上电压依赖型延迟整流性钾通道电流,观察锌离子对钾通道电流密度的影响,并观察钾通道电流的改变与细胞凋亡之间是否存在时间相关性;利用RT-PCR检测锌离子对细胞内Bcl-2、Bax mRNA表达的影响;利用流式细胞仪检测线粒体跨膜电位（mitochondrial transmembrane potential,Δψm）及caspase-3活性的变化;最后应用钾通道阻断剂四氯季胺（TEA）观察阻断钾通道电流后是否能抑制细胞凋亡的发生。结果如下:1.不同剂量的锌离子处理MES23.5细胞24 h后,细胞存活率发生改变。较高剂量的锌离子（70,80,90μmol/L）造成细胞存活率明显降低（P＜0.01）;低剂量的锌离子（30,40,50μmol/L）对细胞存活率没有影响（P＞0.05）。60μmol/L锌离子可以降低细胞存活率但不具有统计学意义。2.不同剂量的锌离子处理MES23.5细胞24h后,细胞出现不同程度的凋亡改变。60μmol/L和90μmol/L的锌离子可以造成明显的细胞凋亡,胞体变圆,细胞核固缩,染色质凝集,凋亡细胞比例分别为13.38±0.6%和22.66±1.1%（P＜0.01）。30μmol/L锌离子处理组与正常对照组相比差别不具有统计学意义（P＞0.05）。3.60μmol/L锌离子处理MES23.5细胞24 h后,细胞内TH蛋白表达量较正常对照组明显降低（P＜0.01）;TH mRNA表达量变化与蛋白表达量变化一致,较正常对照组明显降低（P＜0.01）;同时细胞内DA的含量也低于正常对照组（P＜0.05）。4.MES23.5细胞表达TEA敏感的电压依赖型延迟整流性钾通道电流。锌离子对钾通道电流密度的增强具有时间依赖性。锌离子作用1-2 h对钾通道电流密度没有影响（P＞0.05）,4 h即引起钾通道电流密度明显增高,至8 h达到高峰,16 h时有所降低（P＜0.01）。并且应用20mmol/L TEA可以完全拮抗锌离子增强的钾通道电流密度。5.60μmol/L锌离子处理MES23.5细胞24 h后,细胞内Bcl-2 mRNA表达量降低（P＜0.05）;Bax mRNA表达量没有变化（P＞0.05）;Bcl-2/Bax比值较正常对照组降低（P＜0.05）。6.60μmol/L锌离子处理MES23.5细胞24 h后,细胞内△ψm明显降低,与正常对照组相比差别具有高度统计学意义（P＜0.01）。7.60μmol/L锌离子处理MES23.5细胞1 h、2 h、4 h、8 h、16 h及24 h后,caspase-3活性的变化随锌离子作用时间的延长而逐渐增高。锌离子作用1-8 h对caspase-3的活性没有影响（P＞0.05）,16 h即可出现活性增高（P＜0.05）,24 h显著增高（P＜0.01）。8.60μmol/L锌离子处理MES23.5细胞1 h、2 h、4 h、8 h、16 h及24 h后,凋亡细胞所占比例随锌离子作用时间的延长而逐渐增高。锌离子作用1-8 h后细胞凋亡率没有变化（P＞0.05）;16 h及24 h后细胞凋亡率分别为11.36±1.05%、13.38±0.6%,与正常对照组相比差别具有高度统计学意义（P＜0.01）。9.钾通道阻断剂TEA可以部分抑制细胞凋亡。TEA与锌离子共同处理MES23.5细胞24 h后,caspase-3的活性虽然仍高于正常对照组（P＜0.05）,但与锌离子处理组相比活性出现部分降低（P＜0.05）;TEA与锌离子共同处理MES23.5细胞24 h后,细胞凋亡率虽然仍高于正常对照组（P＜0.05）,但与锌离子处理组相比亦出现部分降低（P＜0.05）。上述结果说明,锌离子可引起MES23.5DA能细胞存活率降低,TH蛋白和mRNA表达水平降低,DA合成减少;锌离子对细胞的损伤作用与诱导细胞凋亡有关;锌离子引起细胞凋亡的机制可能是增强了细胞膜上TEA敏感的电压依赖型延迟整流性钾通道电流,进一步降低Bcl-2 mRNA的表达,降低Bcl-2/Bax比值,影响△ψm,最终激活凋亡关键执行分子caspase-3,从而引起细胞凋亡;应用钾通道阻断剂TEA可以部分拮抗锌离子的毒性,发挥抗凋亡的保护作用。
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