牛轮状病毒HQO9株的分离与鉴定

论文摘要

牛轮状病毒（Bovine Rotavirus,BRV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）,轮状病毒属（Rotavirus）,是引起犊牛病毒性腹泻的主要病原之一。本课题将从2009年黑龙江省齐齐哈尔市某养殖场获得一份犊牛腹泻粪便,进行滤菌处理后,于MA104细胞中连续传代,传至第15代时测得为104.384TCID50/100μl;使用电镜观察病毒粒子形态,可以看到直径大小约70nm,呈典型车轮状的病毒粒子；通过核酸类型实验、脂溶剂敏感性实验,证实该病毒为无囊膜的RNA病毒；该病毒耐酸,经50℃水浴30min处理,感染能力下降明显；通过病毒中和实验,将病毒液与牛轮状病毒参考株阳性血清发生中和反应,中和抗体效价达1：145。根据以上初步鉴定结果推测该分离到的病毒为牛轮状病毒,并命名为HQ09株。根据GenBank中牛轮状病毒NCDV株的序列设计引物,通过RT-PCR扩增了BRV HQ09株的VP5、VP6、VP7、VP8基因。将这四段基因克隆到pMD18-T载体上,进行测序和生物信息学分析：结果表明HQ09VP6基因的CDS区长度是1194bp,编码一个长度为398个氨基酸的蛋白质,系统遗传进化树分析发现分离株HQ09与标准株NCDV、北美B223处在一个分支,核苷酸同源性分别为99.6%、87.8%,我们得出BRV HQ09属于A群轮状病毒；分离株HQ09VP4基因的CDS区长度是2331bp,编码一个长度为777个氨基酸的蛋白质,系统遗传进化树分析发现HQ09与P[1]型的标准株NCDV、北美株O Agent、日本株A5、中国山东分离株CHLY处在一个分支,核苷酸同源性分别为99.9%、97.2%、80.9%、99.6%,表明HQ09为P[1]型；HQ09VP7基因的CDS区长度是981bp,编码一个长度为327个氨基酸的蛋白质,系统遗传进化树分析表明HQ09与G6型的标准株NCDV、北美疫苗株WC3、阿根廷株1730、中国山东分离株CHLY处在一个分支。核苷酸同源性分别为98.9%、97.4%、98.7%、99.6%,上述结果表明BRV HQ09为G6型。以0.2mL/只的剂量用BRV HQ09株对小鼠进行灌胃攻毒,感染小鼠出现腹泻,腹泻潜伏期为1～2天,在3～4天腹泻现象较为明显,5～6天时腹泻现象消失；其临床症状表现包括皮毛光泽差,嗜睡,攻击性强,排浅黄色稀软性粪便等；剖检变化为各段肠道均有不同程度的臌气,肠壁变得菲薄,肠内充满黄色稀薄的黏液样或水样内容物；小肠病理组织学变化明显,肠腺和肠绒毛上皮细胞增生、肿胀、黏液变性、坏死和脱落,小肠绒毛顶端破损,有大量内容物弥散在肠道中,黏膜固有层呈轻度细胞浸润,腺体萎缩破坏。动物实验结果进一步证实小鼠可作为BRV感染动物模型。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 轮状病毒的研究历史及分类
• 1.2 轮状病毒的基本特性
• 1.2.1 轮状病毒的培养特性
• 1.2.2 轮状病毒的理化特性
• 1.3 轮状病毒的分子生物学特性
• 1.3.1 轮状病毒基因组的结构特征
• 1.3.2 轮状病毒蛋白及其功能
• 1.4 轮状病毒的流行病学及其危害
• 1.5 轮状病毒感染机理
• 1.6 轮状病毒的检测方法
• 1.7 实验目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体、工程菌与细胞株
• 2.1.2 试验动物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 标准参照物
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 腹泻病料的处理
• 2.2.2 病毒的培养
• 2.2.3 病毒粒子的电镜观察
• 2.2.4 病毒半数细胞感染量（TCID50）的测定
• 2.2.5 血清中和试验
• 2.2.6 分离病毒理化特性实验
• 2.2.7 分离病毒RT-PCR鉴定
• 2.2.8 攻毒实验
• 3 实验结果
• 3.1 病毒的分离培养
• 3.2 病毒粒子的电镜观察
• 3.3 分离病毒的TCID50测定结果
• 3.4 分离病毒理化特性的测定结果
• 3.5 血清中和试验
• 3.6 病毒分子生物学鉴定结果
• 3.6.1 病毒RT-PCR鉴定结果
• 3.6.2 重组质粒的双酶切鉴定结果
• 3.6.3 分离株HQ09主要结构基因序列分析
• 3.7 攻毒试验结果
• 3.7.1 临床症状与剖检变化结果
• 3.7.2 镜检结果
• 4 讨论
• 4.1 病毒的分离培养
• 4.2 病毒理化特性的研究
• 4.3 病毒主要结构基因的克隆与序列分析
• 4.4 攻毒试验
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文